3D打印技術結合PDGFB-LG4融合蛋白，破解骨缺損修復難題

來源：EngineeringForLife

骨組織工程的一個中心重點是構建血管系統(tǒng)，為細胞生存提供營養(yǎng)，清除代謝廢物，并加速組織再生。血小板衍生生長因子-BB（PDGFB）具有刺激血管形成和骨再生的能力；然而，由于給藥系統(tǒng)不理想，其臨床應用受到副作用和低療效的阻礙。

近期，南京大學趙建寧/上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院雷東團隊設計了一種與硫酸乙酰肝素（HS）交聯(lián)的仿生血管支架，用于持續(xù)遞送PDGFB變體，以促進臨界大小骨缺損的再生（圖1）。

相關研究成果以“3D-Printed Biomimetic Vascular Scaffold Crosslinked with Heparan Sulfate for Sustained Release of PDGFB-LG4 Fusion Protein Promotes Bone Regeneration”為題于2025年3月27日發(fā)表在《Advanced Science》上。

圖1 PCLHS-PDGFB-LG4支架制備示意圖

1. 仿生血管支架的制備及表征
研究者采用了一種反向成型3D打印方法來制造具有血管樣層次結構的仿生血管支架（圖1）。通過加熱使蔗糖逐漸焦糖化，從而獲得良好的擠出成型性，使用3D打印機將焦糖墨水擠出成連續(xù)的單纖維（圖2C）。根據(jù)打印路徑，將熔化的焦糖墨水堆疊成多層層板，形成模板（圖2D、E）。3D打印參數(shù)直接影響模板的宏觀和微觀結構，進而影響仿生血管網(wǎng)絡支架的形態(tài)。SEM顯示，支架展現(xiàn)出多級血管樣結構（圖2G）。微通道堆疊形成多層中空框架，通道相互連接形成多分支網(wǎng)絡。通道表面存在大量微孔，使通道壁具有滲透性。這種血管樣結構能夠支持生理相關的灌注，模擬三維中的微血管網(wǎng)絡進行物質傳遞。盡管通道壁薄且多孔，但支架展現(xiàn)出良好的延展性（圖2H）。單軸壓縮測試表明，支架的模量為13.4 ± 1.7 kPa（圖2I）。此外，循環(huán)壓縮測試顯示支架具有優(yōu)越的彈性和抗疲勞性能，在動態(tài)壓力下幾乎沒有滯后現(xiàn)象（圖2J）。支架的彈性使其能夠抵抗多種拉伸和壓縮變形，并在各種應用中保持原始管狀結構。   

圖2 仿生支架的表征

2. 硫酸乙酰肝素與仿生血管支架的結合和蛋白質釋放
隨后，研究者通過XPS確認了HS在PCL支架表面的成功涂層，結果顯示PCLHS支架在168.86 eV處有一個峰值，對應于PCLHS支架表面存在的S原子（圖2K、L）。甲苯藍染色進一步證明了HS成功交聯(lián)到支架上（圖2F）。此外，還研究了PDGFB和PDGFB-LG4在PCLHS支架上的釋放行為，結果表明PDGFB的釋放速率更快，而PDGFB-LG4的釋放速率相對較慢，這表明HS對PDGFB-LG4具有更強的吸附性，顯示出高親和力，從而延遲了PDGFB-LG4的釋放（圖2M）。這些結果表明，HS能夠有效地與支架結合，并通過靜電相互作用延遲PDGFB-LG4的釋放，從而實現(xiàn)更持久的蛋白質釋放。   

3.體外細胞增殖和附著測定
通過CCK-8實驗評估了HS、PDGFB和PDGFB-LG4對人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）和骨髓間充質干細胞（BMSCs）增殖的影響，結果顯示， HS、PDGFB和PDGFB-LG4組在1、3和5天時的細胞增殖顯著增加（圖3M、N）。此外，細胞附著實驗表明，只有PDGFB-LG4顯著增強了兩種細胞的附著，而HS和PDGFB單獨使用時未顯示出對細胞附著的改善（圖3L）。這些結果表明，PDGFB-LG4在促進細胞增殖和附著方面具有顯著優(yōu)勢，這可能與其通過靜電相互作用與HS結合的能力有關，從而延長了其在支架上的保留時間，增強了局部治療效果。   

圖3 HS和PDGFB變體的成骨和血管生成潛力

4.成骨活性及血管生成活性分析
研究者通過堿性磷酸酶（ALP）活性檢測、鈣沉積分析和成骨相關基因表達的評估來分析這些物質的成骨效果。ALP染色結果顯示， HS、PDGFB和PDGFB-LG4組在培養(yǎng)7天和14天時顯著增強了BMSCs的ALP活性，其中PDGFB-LG4組的ALP活性最高（圖3A、C）。礦化沉積結果顯示PDGFB-LG4組的礦化基質形成最為顯著（圖3B、D）。此外，通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，HS和PDGFB-LG4顯著上調了成骨相關基因的表達（圖4E）。這些結果表明，HS和PDGFB-LG4顯著促進了BMSCs的成骨分化，且PDGFB-LG4在促進ALP活性和鈣沉積方面比PDGFB更有效，顯示出更強的成骨誘導能力。   

研究者通過劃痕愈合實驗、Transwell遷移實驗和體外管狀形成實驗來評估這些物質對細胞遷移和血管生成的促進作用。劃痕愈合實驗顯示，PDGFB和PDGFB-LG4組的細胞遷移能力顯著優(yōu)于對照組，尤其是PDGFB-LG4組在24小時（BMSCs）和48小時（HUVECs）時的傷口閉合率最高（圖3E、H）。Transwell遷移實驗進一步驗證了PDGFB變體誘導HUVECs遷移的潛力，PDGFB-LG4組的遷移細胞數(shù)量顯著多于PDGFB組（圖3F、I）。體外管狀形成實驗表明，PDGFB和PDGFB-LG4組的HUVECs形成的管狀網(wǎng)絡參數(shù)（分支數(shù)量和總分支長度）顯著優(yōu)于對照組，但兩組之間沒有顯著差異（圖3G、J、K）。這些結果表明，PDGFB-LG4在促進細胞遷移和血管生成方面具有顯著優(yōu)勢，可能與其通過靜電相互作用與HS結合的能力有關，從而延長了其在支架上的保留時間，增強了局部治療效果。

5. 復合支架的生物相容性和成骨評價
隨后，研究者通過CCK-8實驗和活死染色評估了BMSCs和HUVECs在不同復合支架上的細胞增殖和生物相容性。CCK-8結果顯示，所有組的細胞數(shù)量在5天內均有所增加，其中PCLHS-PDGFB和PCLHS-PDGFB-LG4組的細胞增殖顯著高于其他組（圖4C、D）。活死染色顯示，BMSCs和HUVECs在所有組中均能有效粘附和鋪展，表明良好的生物相容性（圖4A、B）。此外，通過qRT-PCR分析了BMSCs在不同復合支架上培養(yǎng)14天后的成骨相關基因表達，結果顯示PCLHS-PDGFB-LG4組的成骨相關基因表達最高（圖4F）。RNA測序進一步揭示了PCLHS-PDGFB-LG4組與PCLHS-PDGFB組相比，激活了NF-kappa B信號通路和細胞粘附分子，這些信號通路的激活有助于增強BMSCs的成骨分化（圖5）。這些結果表明，PCLHS-PDGFB-LG4復合支架在促進細胞增殖和成骨分化方面具有顯著優(yōu)勢。   

圖4 復合支架的生物相容性和體外成骨  

圖5 復合支架的RNA-seq結果

6. 復合支架促進體內骨形成

研究者在大鼠顱骨缺損模型中評估了不同支架的骨再生效果。通過micro-CT分析，結果顯示PCLHS-PDGFB-LG4組在4周和8周時的新骨形成量顯著高于其他組（圖6A）。骨體積與總體積比（BV/TV）和覆蓋分析進一步證實了這一結果（圖6B、C）。組織學分析顯示，PCLHS-PDGFB-LG4組在缺陷區(qū)域中心觀察到明顯的骨組織形成，且無明顯炎癥反應或壞死，表明支架具有良好的生物相容性（圖7A、B）。免疫熒光染色顯示，PCLHS-PDGFB-LG4組在CD31、COL1和RUNX2的表達上顯示出最高的熒光信號，表明其在血管化和骨再生方面的優(yōu)越性（圖8）。這些結果表明，PCLHS-PDGFB-LG4復合支架在體內能夠顯著促進骨形成和血管化，且在較低劑量下表現(xiàn)出比PDGFB更好的骨再生效果。   

圖6 不同支架的體內骨再生評估

圖7 通過組織學染色評估體內骨再生

圖8 通過免疫熒光染色評估體內骨再生

綜上，本文成功設計了一種與HS交聯(lián)的仿生血管支架，用于持續(xù)遞送PDGFB-LG4融合蛋白，在較低劑量下促進骨再生。維管狀支架具有多分支微通道和可滲透多孔壁，促進質量交換和細胞浸潤。與PDGFB相比，PDGFB-LG4表現(xiàn)出優(yōu)異的骨誘導和血管生成活性。這種方法可能適用于其他生長因子和明膠基材料，在再生醫(yī)學中具有廣泛的應用潛力。  

參考資料：https://doi.org/10.1002/advs.202414362