體積生物3D打印秒速構(gòu)建異細(xì)胞類骨組織

來源：EFL生物3D打印與生物制造

在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，研發(fā)能模擬生理組織結(jié)構(gòu)和功能的三維細(xì)胞構(gòu)建體意義重大，3D打印與模擬細(xì)胞外基質(zhì)的材料相結(jié)合推動了該領(lǐng)域發(fā)展，但傳統(tǒng)基于逐層沉積的3D生物打印技術(shù)存在打印時間長、支架孔隙率和構(gòu)建體尺寸難以滿足臨床需求等問題。  

蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院Xiao-Hua Qin助理教授團(tuán)隊利用斷層掃描體積生物打�。╒BP）技術(shù)，將柔軟的明膠甲基丙烯�；�（GelMA）生物樹脂與三維內(nèi)皮共培養(yǎng)相結(jié)合，致力于解決現(xiàn)有問題。研究人員對一系列不同GelMA和光引發(fā)劑濃度的生物樹脂進(jìn)行了表征，篩選出最佳配方，實現(xiàn)了在30秒內(nèi)以高細(xì)胞活力打印復(fù)雜可灌注構(gòu)建體。同時，研究了內(nèi)皮共培養(yǎng)對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）成骨分化的影響，并成功構(gòu)建了可灌注的預(yù)血管化模型。相關(guān)工作以“Tomographic volumetric bioprinting of heterocellular bone-like tissues in seconds”為題發(fā)表在《Acta Biomaterialia》上。該研究為骨組織工程提供了新的策略，有望推動再生醫(yī)學(xué)和體外藥物篩選等領(lǐng)域的發(fā)展。

研究內(nèi)容
1. 斷層掃描體積生物打印構(gòu)建體的優(yōu)化研究
通過制備不同GelMA濃度和LAP濃度的生物樹脂，進(jìn)行激光劑量測試、原位光流變測量、機(jī)械性能測試以及細(xì)胞活性和形態(tài)分析等方法，研究適用于體積生物打�。╒BP）且有利于骨組織工程的生物樹脂配方。結(jié)果表明，5% GelMA和0.05% LAP的生物樹脂為最佳配方，其兼具良好的打印性能、較低的剛度，能為細(xì)胞提供適宜環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞鋪展和hMSC的成骨分化，且細(xì)胞活力大于90%。

圖1. 血管內(nèi)皮共培養(yǎng)增強(qiáng)VBP和干細(xì)胞成骨分化

圖2. VBP打印具有中空通道結(jié)構(gòu)的體外模型

2. 光引發(fā)劑濃度對生物打印影響的探究
運(yùn)用共聚焦顯微鏡觀察染色后的打印構(gòu)建體表面、原位光流變監(jiān)測生物樹脂交聯(lián)過程、Zwick機(jī)械測試機(jī)測定凝膠壓縮模量以及進(jìn)行細(xì)胞活性和形態(tài)學(xué)分析等方法，研究不同LAP濃度結(jié)合相應(yīng)光劑量對打印精度、凝膠物理性質(zhì)和細(xì)胞活性的影響。結(jié)果顯示，LAP濃度影響生物樹脂的光交聯(lián)效率和剛度，0.05% LAP的生物樹脂綜合性能最佳，在保證打印精度的同時，對細(xì)胞活性無顯著不良影響，有利于細(xì)胞鋪展。

圖3. 用伊紅Y染色和共聚焦熒光顯微鏡評價印刷結(jié)構(gòu)體的表面光滑度

圖4.LAP光引發(fā)劑濃度對凝膠交聯(lián)、硬度和細(xì)胞活性的影響

3. 內(nèi)皮共培養(yǎng)對hMSC成骨分化的作用研究
采用建立hMSC與HUVEC共培養(yǎng)體系，利用qPCR定量分析成骨和早期成骨細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)、進(jìn)行ALP活性測定以及監(jiān)測凝膠壓縮模量變化等方法，研究內(nèi)皮共培養(yǎng)對3D打印構(gòu)建體中hMSC體外成骨分化和功能的影響。結(jié)果表明，共培養(yǎng)體系在成骨早期，多數(shù)成骨標(biāo)記基因在單培養(yǎng)中表達(dá)較高，后期共培養(yǎng)中表達(dá)增強(qiáng)，尤其在21天后早期成骨細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)顯著增加，且共培養(yǎng)的凝膠壓縮模量隨時間顯著提高，意味著共培養(yǎng)促進(jìn)了基質(zhì)分泌。

圖5. 3D共培養(yǎng)和單培養(yǎng)中骨分化的功能分析  

4. 預(yù)血管化構(gòu)建體的體積生物打印研究
運(yùn)用設(shè)計并打印含hMSC的帶中空通道凝膠構(gòu)建體，在通道中注入HUVEC細(xì)胞懸液，通過共聚焦顯微鏡成像觀察等方法，研究利用VBP技術(shù)構(gòu)建可灌注預(yù)血管化骨構(gòu)建體的可行性。結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了通道內(nèi)有自組織內(nèi)皮單層的預(yù)血管化模型，證明該方法可行，為后續(xù)研究流體誘導(dǎo)的剪切應(yīng)力對細(xì)胞成熟和基質(zhì)礦化的影響奠定了基礎(chǔ)，但打印分辨率和內(nèi)皮細(xì)胞接種方法仍需優(yōu)化。

圖6. 異細(xì)胞可灌注預(yù)血管化模型的建立

研究結(jié)論
本研究展示了通過斷層掃描體積生物打�。╒BP）技術(shù)，結(jié)合三維內(nèi)皮共培養(yǎng)，能快速構(gòu)建厘米級載細(xì)胞水凝膠構(gòu)建體，促進(jìn)體外成骨。通過系統(tǒng)篩選生物樹脂成分，確定了5% GelMA和0.05% LAP的軟生物樹脂，其具有良好的打印性和細(xì)胞相容性。與10% GelMA的基準(zhǔn)生物樹脂相比，該樹脂更柔軟，有利于細(xì)胞 - 基質(zhì)重塑和細(xì)胞間通訊。對hMSC/HUVEC三維共培養(yǎng)和hMSC單培養(yǎng)進(jìn)行六周的功能分析，結(jié)果顯示共培養(yǎng)體系在21天后，三維打印構(gòu)建體中早期成骨細(xì)胞標(biāo)記物（PDPN和DMP1）的表達(dá)增強(qiáng)，意味著共培養(yǎng)加速了成骨分化。此外，還成功構(gòu)建了帶有內(nèi)皮細(xì)胞襯里的可灌注預(yù)血管化構(gòu)建體。

挑戰(zhàn)與展望
本研究雖取得一定成果，但仍面臨挑戰(zhàn)。目前構(gòu)建體的基質(zhì)礦化水平有限，且缺乏成熟的成骨細(xì)胞基因特征，需要進(jìn)一步優(yōu)化體外成骨分化策略。未來可通過實施光學(xué)調(diào)諧方法、引入其他促進(jìn)成骨的參數(shù)（如與巨噬細(xì)胞/破骨細(xì)胞共培養(yǎng)、機(jī)械刺激）以及升級體外平臺進(jìn)行機(jī)械加載實驗等方式，提高組織成熟度和功能。同時，優(yōu)化VBP的分辨率和內(nèi)皮細(xì)胞接種方法，有助于實現(xiàn)生理微血管化。該共培養(yǎng)VBP平臺有望在再生醫(yī)學(xué)和體外藥物發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域，快速規(guī)�；�制造更復(fù)雜的人體組織。

文章來源：
https://doi.org/10.1016/j.actbio.2022.06.020