綠色又安全，3D打印膠原水凝膠：從材料設(shè)計(jì)、打印方式到應(yīng)用

來源： EFL生物3D打印與生物制造

近年來，3D打印技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用迅速發(fā)展，尤其是在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中展現(xiàn)出了巨大的潛力。其中，膠原水凝膠因其獨(dú)特的材料特性和優(yōu)異的生物相容性，成為了研究的熱點(diǎn)。膠原作為一種人體內(nèi)天然存在的結(jié)構(gòu)蛋白，具有保留三螺旋結(jié)構(gòu)的能力，不僅提供了與天然組織相仿的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，還在促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖和分化方面具有顯著優(yōu)勢。相比于傳統(tǒng)的合成聚合物，膠原水凝膠因其天然來源、可生物降解性和低免疫原性，為3D生物打印在臨床應(yīng)用中提供了一個(gè)綠色、安全和高效的替代方案。

在實(shí)際應(yīng)用中，膠原水凝膠的設(shè)計(jì)與優(yōu)化需要針對(duì)不同的生物醫(yī)學(xué)需求進(jìn)行調(diào)整。通過化學(xué)修飾如甲基丙烯酸化（CMA）和物理交聯(lián)等方式，膠原水凝膠的機(jī)械性能、打印穩(wěn)定性和生物活性得到了顯著提升。這種材料不僅適用于常見的擠出式3D打印，還在數(shù)字光處理（DLP）等高精度打印技術(shù)中表現(xiàn)出色。為了進(jìn)一步提高材料的可打印性和功能性，研究者們還引入了輔料如透明質(zhì)酸、明膠等，形成復(fù)合水凝膠系統(tǒng)，能夠更好地控制細(xì)胞行為和組織構(gòu)建。

3D打印膠原水凝膠因其材料設(shè)計(jì)靈活性、打印方式多樣性以及優(yōu)異的生物相容性和功能性，在再生醫(yī)學(xué)和組織工程中展現(xiàn)了廣泛的應(yīng)用潛力和臨床適用性。通過不斷優(yōu)化材料特性和打印技術(shù)，這種綠色、安全的生物墨水正逐步成為未來個(gè)性化醫(yī)療和組織再生的重要工具。本期EFL為大家系統(tǒng)總結(jié)了10篇關(guān)于膠原水凝膠3D打印的創(chuàng)新應(yīng)用和前沿研究，探討其在不同生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的具體應(yīng)用、挑戰(zhàn)以及未來發(fā)展方向。

文獻(xiàn)1：《Adv. Healthcare Mater.》在微凝膠浴中嵌入膠原蛋白的3D生物打印，以控制水凝膠微觀結(jié)構(gòu)和細(xì)胞擴(kuò)散
材料設(shè)計(jì)：文獻(xiàn)中使用了兩種類型的膠原墨水來進(jìn)行嵌入式3D生物打印：物理自組裝的膠原（PHYS）和通過生物正交點(diǎn)擊化學(xué)交聯(lián)的膠原（SPAAC）。PHYS膠原通過在生理溫度下形成纖維自組裝成凝膠，而SPAAC膠原則通過一種應(yīng)變促進(jìn)的疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)（strain-promoted azide-alkyne cycloaddition, SPAAC）進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)。此外，文獻(xiàn)中還詳細(xì)描述了各種支撐浴的制備，包括Pluronic F-127支撐浴、Carbopol支撐浴以及明膠微粒支撐浴。   

打印方式：采用雙噴嘴3D生物打印系統(tǒng)進(jìn)行嵌入式打印。

材料應(yīng)用：本文研究了在嵌入式3D生物打印中使用明膠微粒支撐浴進(jìn)行打印的膠原水凝膠的應(yīng)用，特別是在控制水凝膠微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞行為方面的應(yīng)用。研究表明，通過選擇合適的支撐浴和交聯(lián)化學(xué)方法，可以在保持打印結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的同時(shí)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的良好擴(kuò)展。此外，具有大孔隙結(jié)構(gòu)的SPAAC膠原水凝膠可以顯著提高角膜基質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的擴(kuò)展能力，這對(duì)于組織工程應(yīng)用具有潛在的優(yōu)勢。

文章來源：https://doi.org/10.1002/adhm.202303325

文獻(xiàn)2：《Adv. Healthcare Mater.》利用低濃度膠原蛋白為基礎(chǔ)的生物墨水進(jìn)行乳腺腫瘤細(xì)胞和類器官的嵌入生物打印
材料設(shè)計(jì)：使用了一種基于低濃度I型膠原的生物墨水，并與熱響應(yīng)的透明質(zhì)酸（HA）基聚合物組合，稱為膠原-HA-pNIPAM (CH) 生物墨水。該生物墨水被優(yōu)化用于嵌入式3D生物打印，適用于乳腺癌細(xì)胞和癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）。研究還使用生物相容且物理交聯(lián)的絲蛋白水凝膠作為支撐浴，用于嵌入式3D打印，以支持低粘度膠原生物墨水的打印。

打印方式：使用嵌入式3D生物打印技術(shù)在絲蛋白水凝膠支撐浴中進(jìn)行打印。

材料應(yīng)用：本研究中的材料應(yīng)用于嵌入式3D打印乳腺癌腫瘤模型和血管化腫瘤模型，以模擬體內(nèi)腫瘤形態(tài)和微環(huán)境特征。研究結(jié)果表明，使用CH生物墨水的打印模型能夠更好地保持癌細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的空間組織和表型，類似于體內(nèi)腫瘤組織。這種方法為未來的藥物發(fā)現(xiàn)研究提供了技術(shù)優(yōu)勢，并在乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)和藥物篩選研究中展示了潛力。

文章來源：https://doi.org/10.1002/adhm.202300905

文獻(xiàn)3：《Adv. Healthcare Mater.》在檸檬酸鹽調(diào)制結(jié)冷膠微凝膠浴中增強(qiáng)分辨率的膠原蛋白支架3D打印
材料設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)了一種新型的支撐浴，使用改良的結(jié)冷膠（Gellan Gum, GG）微凝膠浴來實(shí)現(xiàn)高分辨率的3D打印。通過引入檸檬酸三鈉（TSC）到GG微凝膠浴中，抑制了微凝膠的聚集，形成了均勻的浴形態(tài)，并通過TSC的脫水效應(yīng)抑制了膠原墨水在浴中的擴(kuò)散。這種設(shè)計(jì)有效地提高了打印的分辨率。

打印方式：采用BIO-X生物打印機(jī)，在GG微凝膠浴中進(jìn)行嵌入式打印。

材料應(yīng)用：該研究的材料應(yīng)用于打印各種復(fù)雜的3D生物結(jié)構(gòu)，如手、耳朵和人類心臟模型。通過調(diào)節(jié)GG微凝膠浴的粒徑和分散性，打印出的膠原模型能夠精確再現(xiàn)復(fù)雜的解剖結(jié)構(gòu)，并顯示出良好的生物相容性。這些打印結(jié)構(gòu)在與人體誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞（HiPS-CM）共培養(yǎng)后，顯示出周期性跳動(dòng)行為，表明其在組織工程和醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有潛力。

文章來源：https://doi.org/10.1002/adhm.202301090

文獻(xiàn)4：《Adv. Healthcare Mater.》基于膠原蛋白的低粘度復(fù)合材料的神經(jīng)血管組織3D生物打印模型
材料設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)了一種低粘度的海藻酸鈉/膠原復(fù)合生物墨水用于神經(jīng)血管組織的3D打印。生物墨水由海藻酸鈉和膠原組成，通過在打印過程中使用CaCl2進(jìn)行瞬時(shí)交聯(lián)，以增強(qiáng)其粘彈性和穩(wěn)定性；在培養(yǎng)階段，通過添加海藻酸裂解酶（alginate lyase）裂解海藻酸部分，降低水凝膠的剛度，增加孔隙度，為細(xì)胞提供類似于腦基質(zhì)的微環(huán)境。這種設(shè)計(jì)能夠動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)材料的機(jī)械性能和微結(jié)構(gòu)，適應(yīng)神經(jīng)血管單元（NVU）模型的構(gòu)建需求。   

打印方式：結(jié)合嵌入式3D打印和熱鑄工藝構(gòu)建神經(jīng)血管單元（NVU）模型。

材料應(yīng)用：該研究中的材料應(yīng)用于神經(jīng)血管單元（NVU）模型的3D打印和體外仿生結(jié)構(gòu)構(gòu)建。結(jié)果顯示，使用這種低粘度的生物墨水能夠打印出具有多層同軸結(jié)構(gòu)的神經(jīng)血管模型，其中內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出緊密連接蛋白的表達(dá)和選擇性通透性，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞則在外層分支擴(kuò)展并與內(nèi)皮細(xì)胞直接相互作用。這種仿生模型為進(jìn)一步研究NVU功能、神經(jīng)藥物篩選及腦疾病模型構(gòu)建提供了新的思路和方法。

文章來源：https://doi.org/10.1002/adhm.202300004

文獻(xiàn)5：《Biofabrication》生物打印光交聯(lián)中性溶解膠原蛋白，構(gòu)建細(xì)胞取向可編程的可植入結(jié)締組織
材料設(shè)計(jì)：該研究設(shè)計(jì)了一種基于光交聯(lián)的中性溶解膠原（NorCol）的生物墨水，用于打印具有細(xì)胞可編程取向的可植入結(jié)締組織。NorCol通過將酸溶性膠原與5-降冰片烯-2,3-二羧酸酐反應(yīng)合成，保留了完整的膠原分子結(jié)構(gòu)，具有出色的剪切變稀和自愈性能。通過調(diào)整打印過程中自由硫醇基的數(shù)量和原位輻照強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)支撐材料與細(xì)胞負(fù)載水凝膠之間的穩(wěn)定粘附界面，從而構(gòu)建幾何結(jié)構(gòu)引導(dǎo)和模量無關(guān)的各向異性機(jī)械環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞取向。   

打印方式：采用SLA Bioprinter Pro生物打印機(jī)進(jìn)行擠出式3D打印，并通過紫外光交聯(lián)。

材料應(yīng)用：該研究的材料應(yīng)用于可植入結(jié)締組織的3D打印，能夠構(gòu)建具有細(xì)胞取向的復(fù)雜組織結(jié)構(gòu)。NorCol生物墨水通過調(diào)節(jié)不同濃度的NorCol和控制光交聯(lián)過程，成功打印出具有高機(jī)械強(qiáng)度和細(xì)胞生物相容性的支架結(jié)構(gòu)，并在體外培養(yǎng)中顯示出良好的細(xì)胞增殖和分化性能。這種生物墨水系統(tǒng)為組織工程和再生醫(yī)學(xué)中的結(jié)締組織重建提供了新的方法和潛力。

文章來源：https://doi.org/10.1088/1758-5090/acc760

文獻(xiàn)6：《ACS Materials Lett.》雙光子3D打印可控微凝膠通道研究乳腺癌細(xì)胞遷移（2023.11.13）
材料設(shè)計(jì)：本研究設(shè)計(jì)了一種基于超支化聚乙二醇（PEG）高分子的新型光敏聚合物，用于在微流控芯片中創(chuàng)建可調(diào)控的水凝膠微結(jié)構(gòu)。該聚合物在兩光子激發(fā)下通過環(huán)加成交聯(lián)形成穩(wěn)定的水凝膠微結(jié)構(gòu)。通過這種“水凝膠-水凝膠”打印策略，可以在三通道微流控芯片中的膠原基質(zhì)內(nèi)打印具有可控幾何形狀和力學(xué)性能的水凝膠微結(jié)構(gòu)。

打印方式：通過雙光子共聚焦顯微鏡在預(yù)固化的膠原基質(zhì)中進(jìn)行打印。

材料應(yīng)用：該研究中的材料應(yīng)用于在微流控芯片中創(chuàng)建可調(diào)控的水凝膠限制微環(huán)境，以研究癌細(xì)胞在不同機(jī)械應(yīng)力條件下的遷移行為。結(jié)果表明，MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞在剛性更強(qiáng)的水凝膠限制環(huán)境中顯示出更快的遷移速度，并伴隨YAP的核轉(zhuǎn)位和活化。該平臺(tái)為研究細(xì)胞在受限微環(huán)境中的遷移機(jī)制及其在腫瘤轉(zhuǎn)移中的潛在應(yīng)用提供了一種強(qiáng)大的工具。

文章來源：https://doi.org/10.1021/acsmaterialslett.3c00853   

文獻(xiàn)7：《Biofabrication》一種用于關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的可注射和3D打印的促軟骨透明質(zhì)酸和膠原II型復(fù)合水凝膠（2023.10.27）
材料設(shè)計(jì)：本研究設(shè)計(jì)了一種關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)啟發(fā)的促軟骨生成水凝膠，由甲基丙烯酸化透明質(zhì)酸（MeHA）和不同類型的膠原（I型膠原Col I和II型膠原Col II）復(fù)合而成。MeHA的引入改善了水凝膠的機(jī)械性能，并能夠通過光交聯(lián)形成穩(wěn)定的水凝膠網(wǎng)絡(luò)。研究開發(fā)了三種配方：MeHA-Col I、MeHA-Col I/Col II復(fù)合水凝膠和MeHA-Col II水凝膠。Col I的加入旨在增強(qiáng)水凝膠的機(jī)械穩(wěn)定性，而Col II的加入則增強(qiáng)了軟骨細(xì)胞的生成潛力。

打印方式：采用FRESH（Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels）方法在熱可逆明膠支撐浴中進(jìn)行3D打印。

材料應(yīng)用：該研究開發(fā)的MeHA和膠原基水凝膠用于關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)，能夠通過微創(chuàng)的關(guān)節(jié)鏡注射或3D打印個(gè)性化再生支架進(jìn)行治療。MeHA-Col II水凝膠由于其較高的軟骨基質(zhì)生成能力，被認(rèn)為適用于注射應(yīng)用，而MeHA-Col I/Col II水凝膠由于其較高的機(jī)械穩(wěn)定性和良好的3D打印性能，被認(rèn)為適用于打印個(gè)性化再生支架。研究表明，這些水凝膠能夠有效促進(jìn)MSCs的軟骨分化和特定軟骨基質(zhì)的沉積，為軟骨再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用提供了新的解決方案。

文章來源：https://doi.org/10.1088/1758-5090/ad047a

文獻(xiàn)8：《Biomacromolecules》基于物種的差異對(duì)甲基丙烯酸酯化膠原水凝膠的力學(xué)性能、細(xì)胞相容性和打印性的影響（2022.11.23）
材料設(shè)計(jì)：該研究設(shè)計(jì)了基于甲基丙烯酸化膠原（CMA）的光敏水凝膠，用于細(xì)胞負(fù)載和3D生物打印。通過對(duì)牛、人體和大鼠三種不同來源的膠原進(jìn)行甲基丙烯酸化處理，制備了CMA水凝膠。研究評(píng)估了不同來源的膠原、不同提取方法（酸提取與胃蛋白酶消化）以及不同光引發(fā)劑（Irgacure-2959和LAP）對(duì)CMA水凝膠的機(jī)械性能、細(xì)胞相容性和打印適應(yīng)性的影響。

打印方式：使用FRESH方法在明膠支撐浴中打印CMA水凝膠。

材料應(yīng)用：該研究開發(fā)的CMA水凝膠被應(yīng)用于3D生物打印，特別是在打印復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)和用于組織工程的支架方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。研究結(jié)果顯示，源自人類膠原的CMA具有最佳的打印保真度，適合作為生物墨水用于打印復(fù)雜的組織工程結(jié)構(gòu)。

文章來源：https://doi.org/10.1021/acs.biomac.2c00985

文獻(xiàn)9：《Materials Today Bio》功能化仿生礦化膠原促進(jìn)3D打印鈦合金微孔界面骨整合（2023.12.05）
材料設(shè)計(jì)：該研究設(shè)計(jì)了一種功能化的仿生礦化膠原（FMC）材料，其中加入了海藻酸鈉（SA）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）。FMC材料不僅具有良好的機(jī)械強(qiáng)度，還能夠持續(xù)釋放生長因子以促進(jìn)骨和血管的再生。通過將FMC材料填充到3D打印的鈦合金支架的微孔中，形成一種新的有機(jī)-無機(jī)生物活性界面。隨著FMC的持續(xù)降解，周圍環(huán)境中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）和血管內(nèi)皮細(xì)胞（VECs）被吸引到支架表面，促進(jìn)骨和血管的再生。   

打印方式：電子束熔化系統(tǒng)打印鈦合金支架后填充FMC水凝膠。

材料應(yīng)用：該研究的材料應(yīng)用于促進(jìn)3D打印鈦合金支架與骨組織的整合。研究結(jié)果表明，功能化礦化膠原（FMC）與鈦合金支架的結(jié)合（sTi/VEGF）能夠顯著促進(jìn)骨和血管的再生，從而增強(qiáng)支架與骨組織界面的整合性。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均表明，sTi/VEGF能提高BMSCs的增殖和成骨分化能力，誘導(dǎo)VECs聚集，并增加成骨和血管相關(guān)基因的表達(dá)。植入兔子股骨缺損中后，通過Micro CT和推擠實(shí)驗(yàn)等方法驗(yàn)證了其在促進(jìn)骨整合中的效果。

文章來源：https://doi.org/10.1016/j.mtbio.2023.100896

文獻(xiàn)10：《Materials Today Bio》與甲基丙烯酸明膠（GelMA）相比，光固化膠原基細(xì)胞負(fù)載生物墨水在數(shù)字光處理（DLP）和擠出生物打印中的優(yōu)勢（2023.09.16）
材料設(shè)計(jì)：本研究設(shè)計(jì)了一種改良的甲基丙烯酸化膠原（CMA）光固化生物墨水，利用來源于豬皮的I型膠原，通過在低溫（4℃）和酸性條件（pH < 7.0）下進(jìn)行甲基丙烯酸化處理，以提高其生物相容性和打印性能。CMA生物墨水具有良好的光固化特性，可與Schwann細(xì)胞（SCs）和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）相結(jié)合，適用于數(shù)字光處理（DLP）和擠出式生物打印。與傳統(tǒng)的甲基丙烯酸化明膠（GelMA）相比，CMA保留了膠原特有的三螺旋分子結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞與基質(zhì)之間的信號(hào)傳遞和相互作用。   

打印方式：采用DLP和擠出式3D打印結(jié)合UV光源打印。

材料應(yīng)用：該研究的材料應(yīng)用包括開發(fā)適用于DLP和擠出式3D生物打印的膠原基生物墨水，特別是在構(gòu)建具有嵌入細(xì)胞的三維組織工程支架方面具有應(yīng)用潛力。研究表明，與傳統(tǒng)的GelMA相比，使用CMA生物墨水在DLP打印中具有更高的結(jié)構(gòu)保真度和更光滑的表面，同時(shí)在細(xì)胞增殖、形態(tài)學(xué)和基因表達(dá)方面表現(xiàn)出更優(yōu)異的生物學(xué)性能。這種改良的CMA生物墨水為未來的細(xì)胞負(fù)載3D生物打印提供了新的方向，特別是在神經(jīng)組織再生和骨組織工程中的應(yīng)用。

文章來源：https://doi.org/10.1016/j.mtbio.2023.100799