高性能水凝膠的3D生物打印及干細(xì)胞球體的原位生成

來(lái)源： EngineeringForLife

基于數(shù)字光處理（DLP）的生物打印技術(shù)為水凝膠結(jié)構(gòu)在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的發(fā)展提供巨大的前景。然而，用這種方法創(chuàng)建高性能的水凝膠結(jié)構(gòu)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)樾枰�平衡基質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)，同時(shí)也需要保留被封裝細(xì)胞的細(xì)胞活性。在此，第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院劉銳等提出了一個(gè)簡(jiǎn)單而實(shí)用的策略，通過(guò)原位生成干細(xì)胞球狀體來(lái)進(jìn)行高性能水凝膠結(jié)構(gòu)的3D生物打印。該策略通過(guò)將細(xì)胞/右旋糖酐微滴裝載在甲基丙烯酰化明膠（GelMA）乳液中實(shí)現(xiàn)，其中右旋糖酐作為誘餌捕獲并聚集細(xì)胞用于生物打印，而GelMA可以在不失去結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和保真度的情況下實(shí)現(xiàn)機(jī)械支持。生物打印后，右旋糖酐的浸出導(dǎo)致一個(gè)光滑曲面，促進(jìn)水凝膠結(jié)構(gòu)中球狀體的原位生成。這一過(guò)程顯著提高封裝干細(xì)胞的分化潛能。作為概念驗(yàn)證，本研究將牙髓干細(xì)胞（DPSCs）封裝在水凝膠結(jié)構(gòu)中，展示了它們?cè)隗w內(nèi)牙本質(zhì)和新生血管樣結(jié)構(gòu)中的再生能力。本研究策略使基于DLP的生物打印的高性能水凝膠組織構(gòu)建制造成為可能，有望為多種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用鋪平一條有前途的道路。

相關(guān)研究?jī)?nèi)容以“3D bioprinting of high-performance hydrogel with in-situ birth of stem cell spheroids”為題于2024年9月29日發(fā)表在《Bioactive Materials》上。

圖1 生物墨水的特征

為了在生物打印過(guò)程中能夠原位形成干細(xì)胞球狀體，本研究開發(fā)了一種各向異性的生物墨水，稱為細(xì)胞濃縮生物墨水（CCB），以右旋糖酐作為細(xì)胞誘餌捕獲封裝的干細(xì)胞，以GelMA作為基質(zhì)提供結(jié)構(gòu)支持，從而促進(jìn)高性能水凝膠組織結(jié)構(gòu)的生物打�。▓D1a）。在水凝膠結(jié)構(gòu)形成的基礎(chǔ)上，所有混合細(xì)胞均在右旋右聚糖酐溶液中濃縮，在GelMA溶液中未檢測(cè)到信號(hào)（圖1b）。通過(guò)兩相簡(jiǎn)單組合，可以得到不同大小分布的葡聚糖微滴（圖1c）。在CCB水凝膠固化后，超過(guò)80 %的右旋糖酐在24小時(shí)內(nèi)被有效消除（圖1d）。此外，本研究評(píng)估了所得到水凝膠結(jié)構(gòu)的力學(xué)性能（圖1e）。CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明，多孔結(jié)構(gòu)促進(jìn)封裝的NIH/3T3細(xì)胞的增殖（圖1f）�；�/死熒光染色顯示，生物墨水孵育5天后對(duì)被封裝的細(xì)胞沒(méi)有毒性（圖1g）。掃描電鏡（SEM）證實(shí)，15 %組細(xì)胞呈聚集和擴(kuò)散形態(tài)，而標(biāo)準(zhǔn)組、10 %和7.5 %組細(xì)胞呈圓形（圖1h）�；�/死檢測(cè)和SEM圖像也顯示15 %的細(xì)胞組所需的細(xì)胞活力(圖1i）。根據(jù)上述結(jié)果，將10 %（w/v）的右旋糖酐溶液與15 %（w/v）的GelMA溶液以1：2的體積混合，用于打印組織結(jié)構(gòu)。

圖2 生物墨水的可打印性

通過(guò)利用優(yōu)化的生物墨水配方，本研究打印了幾個(gè)具有代表性的結(jié)構(gòu)，從簡(jiǎn)單的2D模式到具有復(fù)雜內(nèi)外結(jié)構(gòu)的3D結(jié)構(gòu)，用于評(píng)估可打印性。利用生物墨水的優(yōu)勢(shì)，成功創(chuàng)建不同形狀的無(wú)細(xì)胞支架（如車輪、心臟和半月板）（圖2a-c）。同時(shí)，本研究探索了充滿細(xì)胞的生物墨水打印仿生結(jié)構(gòu)的潛力，將細(xì)胞準(zhǔn)確地沉積到指定區(qū)域，以引入更準(zhǔn)確的生理特征。圖2d-f顯示，使用生物墨水的DLP生物打印能夠制造復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型、分層皮膚模型和血管前肝水凝膠模型。以上結(jié)果證明了生物墨水制造高精度結(jié)構(gòu)制造的能力。

圖3 水凝膠結(jié)構(gòu)的3D生物打印可調(diào)節(jié)封裝干細(xì)胞活性，并促進(jìn)MSCs球狀體的原位形成

圖4 水凝膠中rDPSCs的多譜系分化

本研究開發(fā)了一種細(xì)胞濃縮的生物墨水，并假設(shè)所提出的生物墨水可以促進(jìn)干細(xì)胞球狀體的原位誕生。采用大鼠牙髓干細(xì)胞（rDPSCs）來(lái)證明該假設(shè)。如圖3a所示，水凝膠中封裝的rDPSCs在孵育5天內(nèi)表現(xiàn)出較高的細(xì)胞相容性。H&E和鬼筆環(huán)肽染色進(jìn)一步證實(shí)生物墨水促進(jìn)MSCs的3D克隆擴(kuò)增（圖3b、c）。除干細(xì)胞聚集外，CCB組包裹的rDPSCs增殖顯著增強(qiáng)（圖3d）。接下來(lái)，在基因表達(dá)水平上研究封裝rDPSCs在水凝膠中的多能性，結(jié)果顯示，CCB組的干性標(biāo)志物（OCT4、SOX2和NANOG）的表達(dá)顯著上調(diào)（圖4e）。這一結(jié)果表明了生物墨水在封裝干細(xì)胞和促進(jìn)球狀體形成方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，反過(guò)來(lái)又增強(qiáng)其干細(xì)胞特性的維持。為進(jìn)一步研究其轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，本研究檢測(cè)在不同水凝膠結(jié)構(gòu)下培養(yǎng)的rDPSCs的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析（RNA-seq），以分析其差異�；鹕綀D顯示，兩組間有1018個(gè)基因存在差異表達(dá)，其中444個(gè)基因下調(diào)，574個(gè)基因上調(diào)（圖3f）。其干性相關(guān)基因（Egr2、CD44、Lif、Klf4、Klf6）在CCB組中的表達(dá)顯著上調(diào)（圖3g）。GO富集表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)的富集、對(duì)外界刺激的響應(yīng)、細(xì)胞-細(xì)胞粘附的調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的響應(yīng)和組織重塑（圖3h）。為進(jìn)一步研究CCB水凝膠結(jié)構(gòu)中原位rDPSC球狀體形成的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，生成一個(gè)熱圖來(lái)顯示與粘附、細(xì)胞外基質(zhì)組織和血管生成相關(guān)的代表性基因的表達(dá)變化（圖3i）。分析發(fā)現(xiàn)Cdh13、Lgals1、Megf10和Abi3bp與細(xì)胞粘附密切相關(guān)，Col27a1、Mmp13、Mmp14、Adamts7和Gas6是參與細(xì)胞外基質(zhì)組織調(diào)控的關(guān)鍵基因，F(xiàn)gf22、Vegfa、Vegfb和Bmp4參與血管生成。基因集合富集分析（GSEA）表明，細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞連接和細(xì)胞外形成的正調(diào)控作用的富集（圖3j）。綜上所述，CCB水凝膠包裹rDPSC促進(jìn)這些生物過(guò)程和分子功能的富集，有利于組織再生。

為了研究封裝的rDPSCs的分化能力，將制備的水凝膠結(jié)構(gòu)與相應(yīng)的分化培養(yǎng)基共同孵育。如圖4a-d所示，CCB組的rDPSCs在培養(yǎng)期間比標(biāo)準(zhǔn)組的細(xì)胞表達(dá)更高的成骨標(biāo)記基因。如圖4m所示，CCB組中的rDPSCs有更多的礦物質(zhì)沉積。與標(biāo)準(zhǔn)組相比，實(shí)驗(yàn)組封裝的rDPSCs顯示II型膠原和SOX9的成軟骨基因表達(dá)水平更高（圖4e、f）。相反，雖然標(biāo)準(zhǔn)組中Col-1和Col-x的基因表達(dá)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，但它們?cè)诜庋b的rDPSCs中的表達(dá)仍遠(yuǎn)高于CCB組（圖4g、h）。誘導(dǎo)21天后，用沙黃O染色法鑒定富含蛋白多糖基質(zhì)的存在。CCB組的沙黃O染色強(qiáng)度強(qiáng)烈，表明GAG的產(chǎn)生程度最大（圖4n）。在水凝膠結(jié)構(gòu)中，封裝rDPSCs的成脂分化顯示出與成骨和軟骨分化相似的結(jié)果（圖4i-l、圖4o）。綜上所述，CCB水凝膠可以促進(jìn)干細(xì)胞球狀體的原位生成，從而增強(qiáng)其增殖、多能性和分化。

圖5 生物打印水凝膠在新生血管形成中的應(yīng)用

本研究利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）通過(guò)試管形成和遷移實(shí)驗(yàn)評(píng)估CCB水凝膠結(jié)構(gòu)的血管生成潛力。如圖5a所示，在由負(fù)載DPSC的CCB水凝膠結(jié)構(gòu)的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的HUVECs顯示出顯著的形成毛細(xì)血管樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的能力，超過(guò)對(duì)照組。血管生成參數(shù)的顯著改善強(qiáng)調(diào)了CCB水凝膠結(jié)構(gòu)在促進(jìn)血管網(wǎng)絡(luò)形成方面的性能增強(qiáng)（圖5b）。與標(biāo)準(zhǔn)組相比，CCB組的遷移HUVECs計(jì)數(shù)明顯更高（圖5c）。接下來(lái)將hDPSCs和HUVECs結(jié)合制備了混合細(xì)胞球狀體，并在體內(nèi)評(píng)估新生血管的形成情況。將生物打印水凝膠植入裸鼠背部（圖5d）。CCB組在整個(gè)水凝膠中觀察到一個(gè)充滿紅細(xì)胞的豐富血管網(wǎng)絡(luò)（圖5e），表明有強(qiáng)大的血管化。H&E量化結(jié)果顯示，CCB組的血管密度、平均血管直徑和管腔密度均高于標(biāo)準(zhǔn)組（圖5h）。CCB組中CD31陽(yáng)性區(qū)域顯著升高（圖5f、i），表明水凝膠結(jié)構(gòu)有效促進(jìn)體內(nèi)新血管形成。微血管顯示 人CD31染色陽(yáng)性，證實(shí)血管腔內(nèi)有植入的HUVECs（圖5g）。   

圖6 皮下模型中牙髓樣組織的重建

將大鼠來(lái)源的牙本質(zhì)基質(zhì)（TDM）根切片填充3D生物打印水凝膠并植入SD大鼠皮下（圖6a i），以實(shí)現(xiàn)血管生成和牙源性分化（圖6a ii）。植入8周后，對(duì)植入部位的中央、外周區(qū)域進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估（圖6b）。H&E染色結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)組支架無(wú)細(xì)胞內(nèi)容物，近端有少量組織浸潤(rùn)；CCB組表現(xiàn)出顯著的組織再生（圖6c、d）。Masson三色染色顯示，CCB組清晰可見膠原纖維（圖6e）。免疫組化顯示CCB組中的相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)增加，包括牙生成-DSPP（圖6f）、血管-CD31，圖6g）、神經(jīng)-NF200（圖6h），證實(shí)了CCB水凝膠有效促進(jìn)髓-牙本質(zhì)復(fù)合樣組織重建。   

全文小結(jié)
綜上所述，本研究證明了細(xì)胞濃縮生物墨水CCB的適用性，以支持基于DLP的具有干細(xì)胞球狀體原位形成的組織結(jié)構(gòu)的生物打印。本研究開發(fā)的生物墨水有助于高性能水凝膠結(jié)構(gòu)的制造，并顯著提高細(xì)胞活力，同時(shí)保持其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和保真度。這些結(jié)構(gòu)有效地將嵌入的細(xì)胞集中在右旋糖酐階段。受彎曲形態(tài)和高細(xì)胞密度影響的干細(xì)胞傾向于聚集成球狀體，導(dǎo)致干細(xì)胞干性和分化潛能增強(qiáng)。此外，本研究中的水凝膠證明了在體內(nèi)支持血管化和再生牙本質(zhì)的能力�；�于以上數(shù)據(jù)，本研究提出一個(gè)簡(jiǎn)單而實(shí)用的策略，即通過(guò)使用細(xì)胞濃縮生物墨水原位生成干細(xì)胞球狀體生物打印水凝膠組織結(jié)構(gòu)，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中顯示出巨大的潛力。

文章來(lái)源：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.09.033