無需去除懸浮支撐的4S生物3D打印方法

來源： EngineeringForLife

懸浮生物3D打印被廣泛用來制備具有精細特征的水凝膠結(jié)構(gòu)，特別是工程血管網(wǎng)絡(luò)的制造。懸浮生物3D打印可直接將生物墨水打印在懸浮支撐浴中，無需其他支撐介質(zhì)。目前運用較為廣泛的懸浮支撐浴主要包括顆粒狀凝膠材料、復(fù)合凝聚材料和商用增稠類凝膠等。盡管懸浮生物3D打印在工藝、材料、結(jié)構(gòu)等方面取得了許多進展，但其應(yīng)用過程中依然面臨著以下瓶頸：

1. 支撐浴通常使用溫敏性或生物兼容性不佳的材料，打印后需要去除，在復(fù)雜結(jié)構(gòu)，如多細胞結(jié)構(gòu)制造上局限較大；

2. 支撐浴材料尺寸較大（>20μm），打印后表面精度不佳；支撐浴通常采用機械研磨或微流控方式制備，制備方式復(fù)雜，需要現(xiàn)配現(xiàn)用，難以存儲，成本較高。

我們將淀粉類水凝膠引入懸浮支撐浴體系中，提出了無需去除懸浮支撐的4S（Simple，Storable，Stable，Scalable）生物3D打印方法。該懸浮支撐浴可通過加熱淀粉顆粒和明膠進行制備，過程簡單（Simple）;懸浮支撐浴可長期儲存在4℃的冰箱環(huán)境，加熱后即可作為懸浮支撐浴使用，無需現(xiàn)配現(xiàn)用，有較好的存儲性（Storable）;懸浮支撐浴由微米級淀粉顆粒組成，微顆粒尺寸穩(wěn)定（Stable）；懸浮支撐浴有很好的可擴展性（Scalable），可與多種打印材料及懸浮材料復(fù)合使用，如圖1所示。

相關(guān)研究以“Removal-Free and Multicellular Suspension Bath-Based 3D Bioprinting”為題發(fā)表在《Advanced Materials》。浙江大學(xué)的賀永教授和浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院胡懿郃主任為論文共同通訊作者，共同第一作者為浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院李帥研究員、李建平研究員和許鑒研究員。  

圖1 無需去除懸浮支撐的4S生物3D打印方法。A：懸浮支撐浴制備過程簡單，B：懸浮支撐浴可長期儲存，C：懸浮支撐浴淀粉顆粒尺寸穩(wěn)定，D：懸浮支撐浴可擴展，E：懸浮支撐浴可應(yīng)用在多種打印場景及其高精度、多細胞制造功能

研究內(nèi)容
作者首先對淀粉類水凝膠作為懸浮支撐浴的機制進行了探索。由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成的淀粉顆粒在加熱后呈無序狀態(tài)，直鏈淀粉和支鏈淀粉相互分離，淀粉凝膠化（Gelatinization），此時淀粉顆粒主要由支鏈淀粉組成；冷卻后，直鏈淀粉重組，包裹在支鏈淀粉周圍，形成不可逆的淀粉凝膠，也稱為退火過程（Retrogradation）。在淀粉顆粒加熱后引入明膠，直鏈淀粉和明膠之間氫鍵結(jié)合，阻礙退火過程，由支鏈淀粉組成的淀粉顆粒在此體系中呈現(xiàn)出無序狀態(tài)，從而支撐懸浮生物3D打印過程。作者通過打印、離心、XRD和FTIR等手段，驗證了該機制。如圖2所示。

圖2 淀粉類水凝膠作為懸浮支撐浴的機制研究。A：淀粉組成，B：淀粉在水中加熱后的凝膠化過程，C：凝膠化淀粉在冷卻后的退火過程，D：引入明膠阻礙凝膠化淀粉的退火過程，E：淀粉類水凝膠懸浮支撐浴支持懸浮生物3D打印示意圖，F(xiàn)：不同濃度淀粉類水凝膠可打印性，G：不同濃度淀粉類水凝膠離心后的淀粉顆粒體積，H：退火后的淀粉類水凝膠懸浮支撐浴倒置實驗，I：退火后的淀粉類水凝膠懸浮支撐浴在不同條件下的打印結(jié)果，J：淀粉類水凝膠懸浮支撐浴XRD檢測結(jié)果，K：淀粉類水凝膠懸浮支撐浴、淀粉和明膠FTIR檢測結(jié)果   

進一步，作者針對工程血管網(wǎng)絡(luò)制造，在淀粉類水凝膠懸浮支撐浴中打印了不同結(jié)構(gòu)，驗證了淀粉類水凝膠作為懸浮支撐浴的可行性；另外，海藻酸鈉、殼聚糖、硫酸軟骨素、GelMA、SilMA等材料加入到該懸浮支撐浴體系中，擴展了懸浮支撐浴材料的選擇范圍；流變性能測試驗證了淀粉類水凝膠作為懸浮支撐浴所需的剪切變稀性和恢復(fù)性；工程血管網(wǎng)絡(luò)制備方面，作者制備了不同結(jié)構(gòu)的工程血管網(wǎng)絡(luò)，包括分叉狀結(jié)構(gòu)、字母狀結(jié)構(gòu)、視網(wǎng)膜血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)等，視網(wǎng)膜血管網(wǎng)絡(luò)犧牲模板打印過程如視頻1所示，其貫通性測試如視頻2所示，驗證了懸浮生物3D打印制備工程血管網(wǎng)絡(luò)的靈活性。如圖3所示。

圖3 淀粉類水凝膠擴展懸浮支撐浴范圍及工程血管網(wǎng)絡(luò)制備。A：淀粉類水凝膠懸浮支撐浴內(nèi)打印不同間距犧牲模板，B：淀粉類水凝膠懸浮支撐浴內(nèi)打印不同層數(shù)犧牲模板，C：淀粉類水凝膠內(nèi)引入不同水凝膠作為懸浮支撐浴，D&E：淀粉類水凝膠懸浮支撐浴流變測試，F(xiàn)：不同結(jié)構(gòu)工程血管網(wǎng)絡(luò)的制備，G：視網(wǎng)膜血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，H：視網(wǎng)膜血管網(wǎng)絡(luò)打印路徑規(guī)劃，I：視網(wǎng)膜血管網(wǎng)絡(luò)犧牲模板打印結(jié)果，J：視網(wǎng)膜血管網(wǎng)絡(luò)貫通性測試結(jié)果   

在懸浮生物3D打印中，擠出墨水與懸浮支撐浴介質(zhì)直接接觸。因此，懸浮支撐浴中的顆粒大小直接影響工程血管網(wǎng)絡(luò)的表面精度。人體血管網(wǎng)絡(luò)為降低血液流動阻力，其內(nèi)表面較為光滑。因此，為提升工程血管網(wǎng)絡(luò)表面制造精度，作者探索了不同尺寸（品種）淀粉顆粒對工程血管網(wǎng)絡(luò)表面粗糙度的影響。結(jié)果表明，尺寸為4.8±1.4μm的大米淀粉制備的工程血管網(wǎng)絡(luò)表面粗糙度值最低（2.5±0.2μm），非常接近活體主動脈的內(nèi)表面粗糙度（≈2μm）。研究進一步通過球囊止血模擬實驗，驗證了制備高精度工程血管網(wǎng)絡(luò)的重要性。如圖4所示。

圖4 淀粉類水凝膠懸浮支撐浴提升血管網(wǎng)絡(luò)表面精度。A：不同尺寸淀粉顆粒加熱前后尺寸及可打印性，B：不同尺寸淀粉類水凝膠懸浮支撐浴制備的血管網(wǎng)絡(luò)表面精度測試，C：不同尺寸淀粉類水凝膠懸浮支撐浴制備的血管網(wǎng)絡(luò)表面SEM圖，D：不同表面粗糙度血管網(wǎng)絡(luò)止血效應(yīng)，E：止血球囊和測試樣品，F(xiàn)：不同尺寸淀粉類水凝膠懸浮支撐浴制備的血管網(wǎng)絡(luò)止血模擬實驗，G：不同尺寸淀粉類水凝膠懸浮支撐浴制備的血管網(wǎng)絡(luò)阻血模擬結(jié)果   

針對三維實體結(jié)構(gòu)的打印與制造，研究將海藻酸鈉作為打印墨水，實現(xiàn)了不同結(jié)構(gòu)在淀粉類水凝膠懸浮支撐浴中的打印，通過在37℃下去除懸浮支撐浴，可獲得打印結(jié)構(gòu)；另外，GelMA、SilMA、DexMA、AlgMA等材料可以與淀粉結(jié)合，作為打印墨水，在此體系下打印并光固化后，去除懸浮支撐浴，獲得打印結(jié)構(gòu)，擴展了打印墨水范圍；作者進一步打印了分叉血管模型、人手模型和股骨模型，綜合驗證了淀粉類水凝膠也可以作為去除/犧牲材料，實現(xiàn)不同結(jié)構(gòu)的制造。如圖5所示。   

圖5 淀粉類水凝膠懸浮支撐浴作為可去除材料制備三維實體結(jié)構(gòu)。A：低粘度海藻酸鈉在淀粉類水凝膠懸浮支撐浴中的打印結(jié)果，B：低粘度海藻酸鈉在含有鈣離子的淀粉類水凝膠懸浮支撐浴中的打印結(jié)果，C：打印纖維長度定量分析，D：不同纖維結(jié)構(gòu)的打印與制造，E：不同光固化墨水打印網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，F(xiàn)：分叉血管、人手模型和股骨模型的打印

生物相容性方面，作者首先將內(nèi)皮細胞注射到工程血管網(wǎng)絡(luò)內(nèi)，人體血管最重要的組成部分-內(nèi)皮細胞膜可在培養(yǎng)一周后形成；進一步將MC3T3-E1細胞培養(yǎng)在淀粉類水凝膠懸浮支撐浴中，驗證了細胞在該懸浮支撐浴中的活性、生長和成骨分化功能；另外，該懸浮支撐浴可實現(xiàn)不同密度細胞的加載，細胞存活率在培養(yǎng)期間均保持在90%以上；作者將iPSCs誘導(dǎo)的腦類器官培養(yǎng)在該懸浮支撐浴中，經(jīng)過培養(yǎng)后，腦類器官保持了較高的分化功能和干性，進一步驗證營養(yǎng)物質(zhì)在該懸浮支撐浴中的傳輸有效性。如圖6所示。   

圖6 淀粉類水凝膠懸浮支撐浴生物相容性測試。A：內(nèi)皮細胞在不同結(jié)構(gòu)血管網(wǎng)絡(luò)內(nèi)形成內(nèi)皮細胞膜，B：MC3T3-E1細胞在淀粉類水凝膠懸浮支撐浴內(nèi)的活死染色，C：MC3T3-E1細胞在淀粉類水凝膠懸浮支撐浴內(nèi)的生長與鋪展，D：MC3T3-E1細胞在淀粉類水凝膠懸浮支撐浴內(nèi)的存活率，E：MC3T3-E1細胞在淀粉類水凝膠懸浮支撐浴內(nèi)的堿性磷酸酶（ALP）和茜素紅S（ARS）染色，F(xiàn)：MC3T3-E1細胞在淀粉類水凝膠懸浮支撐浴內(nèi)的ALP染色定量分析，G：MC3T3-E1細胞在淀粉類水凝膠懸浮支撐浴內(nèi)的ARS染色定量分析，H&I：MC3T3-E1細胞在淀粉類水凝膠懸浮支撐浴和GelMA中的細胞活性對比，J&K：不同密度MC3T3-E1細胞在淀粉類水凝膠懸浮支撐浴內(nèi)的活性   

針對多細胞梯度結(jié)構(gòu)的制造，作者將多細胞皮膚模型作為目標(biāo)，在該打印體系下加載了血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和角質(zhì)細胞，成功實現(xiàn)了含血管網(wǎng)絡(luò)多細胞梯度結(jié)構(gòu)的打印與制造，如圖7所示，綜合驗證了本文提出的無需去除懸浮支撐的4S生物3D打印方法有效性。

圖7 無需去除懸浮支撐的4S生物3D打印方法制造含血管網(wǎng)絡(luò)多細胞皮膚模型。A：含血管網(wǎng)絡(luò)多細胞皮膚模型打印與制造示意圖，B：制備的皮膚模型內(nèi)多細胞的分布，C&D：含血管網(wǎng)絡(luò)多細胞皮膚模型免疫熒光染色   

文章來源：https://doi.org/10.1002/adma.202406891