3D打印復(fù)合支架促進(jìn)骨形成和血管化

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骨缺損治療的支架應(yīng)支持血管化和促進(jìn)骨形成，以促進(jìn)轉(zhuǎn)化為生物醫(yī)學(xué)設(shè)備應(yīng)用。目前用于骨缺損治療和骨再生的生物材料支架迫切需要改進(jìn)，以增強(qiáng)組織整合、血管化和骨形成，同時(shí)最小化材料的復(fù)雜性。但傳統(tǒng)支架在提供足夠的通道結(jié)構(gòu)以有效的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和廢物清除方面往往面臨限制，因此含有通道的生物材料支架已經(jīng)成為一種潛在的解決方案�；�于此，澳大利亞莫納什大學(xué)Neil R. Cameron、Mikaël M. Martino提出了一種新方法，利用3D打印水溶聚乙烯醇（PVA）犧牲模具，設(shè)計(jì)具有微通道和多尺度孔隙率的聚合高內(nèi)相乳液（polyHIPE）支架。使用熔融沉積模型生成兩個(gè)犧牲模具變體（250 μm和500 μm），填充HIPE，隨后溶解以生成含有微通道的polyHIPE支架。體外評(píng)估顯示，細(xì)胞浸潤(rùn)、增殖和成骨分化顯著增強(qiáng)，強(qiáng)調(diào)微通道對(duì)細(xì)胞行為的良好影響。成骨因子BMP-2實(shí)現(xiàn)較高的負(fù)載效率和可控釋放，微通道促進(jìn)生長(zhǎng)因子的釋放。對(duì)小鼠臨界大小的顱骨缺損模型的評(píng)估顯示，在含有BMP-2的微通道支架中，血管化和骨形成增強(qiáng)。綜上，本研究不僅介紹了一種在polyHIPE支架中創(chuàng)建多尺度孔隙率的可行方法，而且強(qiáng)調(diào)了其增強(qiáng)細(xì)胞浸潤(rùn)、控制生長(zhǎng)因子釋放和體內(nèi)性能的能力。以上發(fā)現(xiàn)表明，polyHIPE支架在骨組織工程和再生醫(yī)學(xué)中有很好的應(yīng)用前景，并有望促進(jìn)這類生物材料支架的轉(zhuǎn)化。

相關(guān)研究?jī)?nèi)容以“Bioactive Polymer Composite Scaffolds Fabricated from 3D Printed Negative Molds Enable Bone Formation and Vascularization”為題于2024年7月30日發(fā)表在《Acta Biomaterialia》。   

圖1 含微通道的多孔DPEHA支架制備

PVA細(xì)絲的3D打印產(chǎn)生在水平面上0、90度觀察到層狀垂直支柱，支柱直徑分別為250 μm和500 μm（圖1A）。在高內(nèi)相乳液（HIPE）紫外光聚合、負(fù)模溶解和支架脫水之后，由此產(chǎn)生的微通道穿過(guò)垂直軸和水平軸上在整個(gè)支架相互連接（圖1B）。SEM圖像顯示，兩個(gè)支架通道表面上有小開(kāi)孔，直徑為250 μm（250μC）和500 μm（500μC）的微通道。

圖2 多尺度孔隙度DPEHA polyHIPE支架的形態(tài)學(xué)特征

PolyHIPE材料的形態(tài)學(xué)特征在所有三種支架變化中都很明顯，如圓形和清晰的孔隙（圖2 A）。對(duì)支架材料孔徑直徑的測(cè)量表明，所有材料的孔尺寸都相似且正偏態(tài)分布，表明犧牲模板對(duì)內(nèi)孔隙直徑的分布沒(méi)有顯著影響（圖2B）。  

圖3 含/不含微通道的DPEHA polyHIPE支架的力學(xué)表征

支架的壓縮模量、極限壓縮屈服強(qiáng)度和應(yīng)力-應(yīng)變曲線的測(cè)量值如圖3所示。結(jié)果顯示，-μC、250μC和500μC支架之間的壓縮模量沒(méi)有顯著差異(圖3A）。與非通道材料相比，250μC和500μC支架的極限抗壓強(qiáng)度均顯著降低（圖3B）。所有支架變化的應(yīng)力-應(yīng)變曲線均顯示出韌性材料具有相當(dāng)大的彈性變形特征（圖3C），其J形非線性曲線代表polyHIPEs和其他生物材料的拉伸試驗(yàn)應(yīng)力-應(yīng)變曲線。250μC和500μC支架在給定的應(yīng)變值下均表現(xiàn)出較低的應(yīng)力值，表明隨著在材料中引入微通道，機(jī)械響應(yīng)發(fā)生改變。   

圖4 多尺度孔隙度DPEHA polyHIPEs支架的體外評(píng)價(jià)

為了研究支架中的微通道是否能增強(qiáng)細(xì)胞在生物材料內(nèi)部的遷移和定植，本研究將MG63骨肉瘤細(xì)胞接種到支架表面，培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)28天（圖4A）。H&E染色顯示，與非通道支架相比，細(xì)胞浸潤(rùn)到更多的內(nèi)部區(qū)域；相反，在沒(méi)有通道的支架中，只有少數(shù)細(xì)胞浸潤(rùn)到靠近支架表面的空隙中（圖4B）。SEM證實(shí)在單個(gè)通道內(nèi)存在細(xì)胞，并觀察到密集的ECM層在通道表面和空間上擴(kuò)散（圖4C）。用刃天青還原試驗(yàn)測(cè)定支架培養(yǎng)4周后，支架中的細(xì)胞活力和增殖情況（圖4D）。結(jié)果與組織學(xué)結(jié)果一致，支架在整個(gè)培養(yǎng)期間均表現(xiàn)出高活力。   

圖5 DPEHA polyHIPE支架中BMP-2的負(fù)載效率和累積釋放譜

接下來(lái)，本研究探索了負(fù)載BMP-2的polyHIPE支架的加載和釋放，以估計(jì)植入后可能發(fā)生的釋放譜。在所有支架中均觀察到相對(duì)較高的加載效果，-μC、250μC和500μC通道支架的負(fù)載效率無(wú)顯著差異（圖5A）。在最初的24小時(shí)內(nèi)，所有的支架均表現(xiàn)出總負(fù)載BMP-2的低突發(fā)釋放，500μC支架的BMP-2累積釋放百分比最高，其次是250μC，-μC支架的釋放譜最低（圖5B）。

圖6 微通道DPEHA polyHIPE支架中MSC的浸潤(rùn)和成骨分化  

微通道PolyHIPE支架沉積在MSC單層上，將細(xì)胞在含有BMP-2的成骨分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周（圖6A）。在培養(yǎng)的第21天，H&E染色顯示，與非通道PolyHIPE支架相比，微通道PolyHIPE支架中的細(xì)胞浸潤(rùn)到更多的內(nèi)部區(qū)域（圖6B）。此外，通道支架中較高的細(xì)胞浸潤(rùn)翻譯較高水平的晚期成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物骨鈣素（圖6C、D）。

圖7 DPEHA polyHIPE支架植入顱骨缺損的血管化研究

本研究通過(guò)微注射MV-122，結(jié)合高分辨率X線CT，觀察犧牲模板polyHIPE支架獲得的三維血管網(wǎng)絡(luò)。血管包圍非負(fù)載支架的表面并靠近上下表面，包圍了polyHIPE支架的側(cè)面。-μC/- BMP-2支架的血管主要在支架外表面。相比之下，250μC/-BMP-2和500μC/-BMP-2支架在整個(gè)支架上都有廣泛的、相互連接的血管浸潤(rùn)（圖7A、B）。

圖8 微通道DPEHA polyHIPE支架誘導(dǎo)骨形成的定量研究

接下來(lái)，用較低分辨率（20 μm）的顯微CT掃描植入物，以量化支架誘導(dǎo)的新骨生長(zhǎng)（圖8 A）。在沒(méi)有BMP-2的支架中，非通道組和通道組在缺損覆蓋、新骨總體積和垂直骨增加方面沒(méi)有顯著差異，而所有BMP-2組均表現(xiàn)出更大的缺損覆蓋范圍和更多新骨形成（圖8B、D）。此外，與通道較小的支架相比，通道較大的支架骨形成顯著增加（圖8C）。與有BMP-2但沒(méi)有微通道的支架相比，有BMP-2和微通道的支架的骨增強(qiáng)量增加近10倍（圖8D），表明微通道顯著促進(jìn)新骨形成。然后對(duì)顱骨組織進(jìn)行組織學(xué)處理，用Masson染色以進(jìn)一步檢查polyHIPE支架內(nèi)的新骨形成和細(xì)胞浸潤(rùn)（圖8E）。   


全文小結(jié)
綜上所述，本研究將乳劑模板與可提取的3D打印結(jié)合，制備了用于骨組織工程的具有多孔孔隙度的聚合物支架。所得到的支架有一個(gè)由乳化液模板產(chǎn)生的完全互聯(lián)的微孔網(wǎng)絡(luò)，以及一個(gè)直徑為250或500 μm的相互連接的網(wǎng)狀微通道網(wǎng)絡(luò)。在體外，骨肉瘤細(xì)胞（MG63）能夠更好地穿透微通道支架并填充支架內(nèi)部。同樣，骨源性MSCs可以從單層培養(yǎng)向上遷移到非通道支架中，增殖并顯示成骨標(biāo)記物。小鼠顱骨缺損模型結(jié)果表明，當(dāng)添加骨誘導(dǎo)因子BMP-2時(shí)，微通道支架的骨誘導(dǎo)作用更大，以及微通道支架促進(jìn)血管化。在500μm+ BMP-2中，8周后顱骨缺損幾乎完全閉合�？傊�，本研究結(jié)果表明，乳劑模板和負(fù)模通道的結(jié)合產(chǎn)生了很有前途的骨組織工程支架。


文章來(lái)源：
https://doi.org/10.1016/j.actbio.2024.07.038