《AFM》：多材料DLP生物打印有可灌注網(wǎng)絡(luò)的異質(zhì)水凝膠

來(lái)源： EFL生物3D打印與生物制造

建立模擬活體組織和器官?gòu)?fù)雜異質(zhì)性的體外模型對(duì)于增強(qiáng)科研人員對(duì)生物機(jī)制的理解以及開(kāi)發(fā)組織工程和再生醫(yī)學(xué)的新藥物和療法至關(guān)重要。傳統(tǒng)的生物打印方法，例如基于擠出和單一材料的數(shù)字光處理（DLP）生物打印，無(wú)法捕捉自然組織復(fù)雜的機(jī)械和結(jié)構(gòu)多樣性。

為了解決這個(gè)問(wèn)題，深圳大學(xué)的孟思副研究員和孔湉湉教授團(tuán)隊(duì)將多材料DLP生物打印與PEGDA-AAm（簡(jiǎn)稱PA）生物墨水相結(jié)合，開(kāi)發(fā)多組分、多模量、充滿細(xì)胞的水凝膠結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)不僅具有異質(zhì)機(jī)械性能，而且還具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和精確設(shè)計(jì)的表面微觀結(jié)構(gòu)。

相關(guān)研究成果以“Multi-Material Digital Light Processing (DLP) Bioprinting of Heterogeneous Hydrogel Constructs with Perfusable Networks”為題于2024年4月8日發(fā)表在《Advanced Functional Materials》上。

為了打印水凝膠結(jié)構(gòu)，使用基于DLP的打印機(jī)來(lái)固化水凝膠前體（圖1），該打印機(jī)具有波長(zhǎng)為405 nm的LED光源，最大光強(qiáng)度為≈100 mW cm−2。為了配制用于DLP打印機(jī)的生物墨水，研究者將AAm和PEGDA分別作為水凝膠的軟結(jié)構(gòu)成分和硬結(jié)構(gòu)成分來(lái)制備水凝膠前體。該配方中，苯基2,4,6-三甲基苯甲酰次膦酸鋰（LAP）作為光引發(fā)劑和紅色食用染料作為光吸收劑。

圖1 用作模擬異質(zhì)人體組織結(jié)構(gòu)的體外模型的水凝膠結(jié)構(gòu)的示意圖

生物墨水的凝膠時(shí)間（Tgel）顯著影響印刷適性。研究者將濃度分別為25、35和50 wt%的1 mL PA生物墨水樣品在玻璃瓶中進(jìn)行10秒的光交聯(lián)。結(jié)果顯示，濃度為25和35 wt%的PA生物墨水僅表現(xiàn)出部分凝膠化，濃度為50 wt%的PA生物墨水顯示出完全凝膠化和凝固，幾乎觀察不到墨水流動(dòng)。這表明50 wt% PA生物墨水具有更快的固化過(guò)程，使其更適合創(chuàng)建復(fù)雜的結(jié)構(gòu)（圖2A）。流變測(cè)試和模量計(jì)算也顯示50%單體濃度的PA生物墨水成為增強(qiáng)可打印性的更有希望的候選者（圖2B-C），使其成為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的首選。此外，研究者優(yōu)化了曝光參數(shù)、光吸收劑含量（最優(yōu)比為1%）、單體濃度和PEGDA:AAm (PA)比例（比例分別為2%、5%和10%），得到可以在水環(huán)境中表現(xiàn)出優(yōu)異結(jié)構(gòu)完整性和尺寸完整性的體外模型構(gòu)建支架材料（圖2D-I）。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示I型膠原蛋白表面處理后軟質(zhì)和硬質(zhì)PA水凝膠均具有出色的生物相容性（圖2J-L），可以作為支持細(xì)胞生長(zhǎng)的基質(zhì)材料具有巨大的潛力。

圖2 水凝膠生物墨水的物理特性、印刷適性和細(xì)胞活力

為了展示DLP生物打印在制造具有可灌注網(wǎng)絡(luò)的充滿細(xì)胞的水凝膠結(jié)構(gòu)方面的潛力，研究者創(chuàng)建了具有直通道和氣管樣通道的微流控芯片。為了驗(yàn)證結(jié)構(gòu)內(nèi)空心通道的成功打印，研究者將呈現(xiàn)藍(lán)色熒光的NIH-3T3細(xì)胞注入這些通道中（圖3A）。文章展示了兩種不同的具有嵌入式中空結(jié)構(gòu)的水凝膠結(jié)構(gòu)的成功構(gòu)建（圖3B，E）。使用共聚焦顯微鏡可以觀察到混合到生物墨水中的Hela-GFP細(xì)胞均勻分布在整個(gè)水凝膠中，而灌注的NIH-3T3細(xì)胞填充了中空通道，它們的藍(lán)色熒光清晰地勾勒出這些嵌入的微通道。綠色熒光Hela-GFP細(xì)胞和藍(lán)色熒光NIH-3T3細(xì)胞之間的明顯區(qū)別，每個(gè)細(xì)胞都局限于特定區(qū)域（圖3C、D、F、G），證明了構(gòu)建體的高保真度。

水凝膠結(jié)構(gòu)的表面拓?fù)湓谟绊懠?xì)胞行為方面起著至關(guān)重要的作用，因此創(chuàng)建具有特定表面拓?fù)湮⒂^結(jié)構(gòu)的水凝膠結(jié)構(gòu)非常重要（圖3H）。為了評(píng)估這些表面拓?fù)湮⒔Y(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞行為的影響，研究者設(shè)計(jì)了兩種類型：螺旋槽微結(jié)構(gòu)和基于三周期最小表面（TPMS）的微結(jié)構(gòu)。螺旋槽微結(jié)構(gòu)對(duì)于引導(dǎo)平滑肌細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞等細(xì)胞的方向特別有效。另一方面，TPMS以其重復(fù)、有組織的模式而聞名，可提供無(wú)中斷的連續(xù)表面（圖3I-P）。

圖3 具有可灌注網(wǎng)絡(luò)和工程表面形貌的載有細(xì)胞的水凝膠結(jié)構(gòu)

復(fù)制肝小葉、皮膚和軟骨等組織和器官固有的各種機(jī)械模量是組織工程中的一個(gè)挑戰(zhàn)。研究者使用多材料DLP技術(shù)和多功能PA生物墨水，將具有不同機(jī)械特性的組件穩(wěn)健地組裝成單個(gè)體外模型。一個(gè)簡(jiǎn)單的例子是PA1和PA2水凝膠的集成，其中它們界面上的粘合是通過(guò)間隙空間中存在的未固化PA生物墨水的固化來(lái)實(shí)現(xiàn)的（圖4A）。將兩種尺寸相同但配方不同的水凝膠組合在一起可產(chǎn)生具有中等且平衡的機(jī)械性能的水凝膠（圖4B）。一個(gè)更復(fù)雜的示例涉及在同一平面上以預(yù)先設(shè)計(jì)的圖案打印PA1和PA3生物墨水并允許它們互連，PA1水凝膠有效地支持了PA3水凝膠的拉伸，并且它們的界面沒(méi)有出現(xiàn)任何破裂或分離（圖4C）。

為了證明多材料DLP在制造生物相關(guān)異質(zhì)組織模型方面的能力，研究者開(kāi)發(fā)了一個(gè)簡(jiǎn)化的肝小葉模型（圖4D），利用藍(lán)色PA1和紅色PA3生物墨水分別代表肝竇和肝板。打印后捕獲的光學(xué)圖像清楚地定義了藍(lán)色和紅色水凝膠之間的邊界，它們具有不同的機(jī)械模量（圖4E）。此外，熒光顯微鏡顯示NIH-3T3和Hela-GFP細(xì)胞均勻分布在其指定的水凝膠區(qū)域內(nèi)（圖4F），有效地實(shí)現(xiàn)了多材料結(jié)構(gòu)內(nèi)多種細(xì)胞類型的區(qū)域特異性封裝。多組分模型的成功創(chuàng)建說(shuō)明了該方法在研究水凝膠材料內(nèi)細(xì)胞相互作用的潛力。此外，研究者還將異質(zhì)性的探索擴(kuò)展到了Z軸，證明了沿z軸構(gòu)建異質(zhì)結(jié)構(gòu)的可行性（圖4G-M）。

圖4 充滿細(xì)胞的多材料異質(zhì)水凝膠結(jié)構(gòu)

綜上，本文演示了充滿細(xì)胞的水凝膠微流體裝置的制造，并探索表面拓?fù)洌ò�括螺旋槽和三周期最小表面）如何指�?dǎo)細(xì)胞行為。這種方法為體外復(fù)制組織和器官結(jié)構(gòu)開(kāi)辟了新途徑。復(fù)合水凝膠和雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的進(jìn)步及其通過(guò)多材料DLP生物打印實(shí)現(xiàn)的精確結(jié)構(gòu)復(fù)制能力的整合，可以在精確模擬骨組織的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和機(jī)械行為方面取得重大進(jìn)展。除了作為體外模型的應(yīng)用之外，本研究還擴(kuò)展了對(duì)血管組織工程和再生醫(yī)學(xué)的見(jiàn)解，特別強(qiáng)調(diào)了這些生物打印材料用作植入物的前景。

文章來(lái)源：
https://doi.org/10.1002/adfm.202316456