體內(nèi)3D打印器官！雙交聯(lián)工藝生物墨水法發(fā)了《Bioact. Mater.》

來源： EngineeringForLife

移植組織和器官短缺是臨床急需解決的問題。原位三維打印技術(shù)可直接在患者體內(nèi)打印出新的組織或器官。但是這一過程中使用的打印墨水對結(jié)果至關(guān)重要，必須滿足特定要求，如快速凝膠化、形狀完整、長期穩(wěn)定以及與周圍健康組織粘附特性。在天然材料中，蠶絲纖維素具有優(yōu)異特性，因此在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中廣泛研究。但蠶絲纖維素還需進一步改進，才能滿足原位三維打印的要求。近日，來自意大利特倫托大學(xué)的Antonella Motta教授團隊進行了使用雙交聯(lián)工藝絲素蛋白墨水進行原位3D打印的相關(guān)研究。研究成果以“Silk fibroin-based inks for in situ 3D printing using a double crosslinking process”為題于01月25日發(fā)表在《Bioactive Materials》上。

本研究利用共價交聯(lián)工藝（包括打印前預(yù)光交聯(lián)和原位酶交聯(lián)），開發(fā)出可用于原位打印的蠶絲纖維素油墨。對兩種不同分子量的蠶絲纖維素進行表征，共價鍵與剪切力協(xié)同效應(yīng)增強蠶絲二級結(jié)構(gòu)向β片層轉(zhuǎn)變，實現(xiàn)快速穩(wěn)定。新開發(fā)的絲素蛋白水凝膠具有良好的機械性能、長期穩(wěn)定性和耐酶降解性，在14天內(nèi)其二級結(jié)構(gòu)和膨脹特性不會隨時間推移而發(fā)生顯著變化。此外，體外實驗也證明其具有明顯的組織粘附性。

本文從以下幾個方面進行詳細描述：
1. 蠶絲纖維素墨水的開發(fā)
2. 蠶絲纖維素墨水的表征
3. 體外生物評估

圖1 雙重交聯(lián)工藝設(shè)計與流程

使用擠壓式3D打印技術(shù)，其墨水必須具有剪切稀化特性、在擠壓過程中形成長絲以及合適的粘度。蠶絲纖維素不符合這些參數(shù)。設(shè)計的第一步就是克服粘度限制。研究人員選擇兩種不同的蠶絲分子量：15 mB和30 mB，以及能形成共價鍵的交聯(lián)工藝，以實現(xiàn)對結(jié)構(gòu)、降解和機械性能更多控制。設(shè)計了一種雙重交聯(lián)工藝，由預(yù)凝膠階段和原位二次交聯(lián)組成，前者是為使蠶絲纖維素可擠出，后者是為穩(wěn)定打印結(jié)構(gòu)（圖1）。打印噴嘴中擠壓應(yīng)力誘導(dǎo)的物理交聯(lián)作用是使無規(guī)線圈快速過渡到β-片層結(jié)構(gòu)，從而進一步穩(wěn)定凝膠。打印出的凝膠形成機械穩(wěn)定系統(tǒng)，支持骨髓間充質(zhì)干細胞粘附和存活，并在模擬組織上具有良好粘附性。

圖2 可打印墨水粘彈性分析

由于預(yù)凝膠是通過光交聯(lián)實現(xiàn)的，因此研究人員進行TNBS檢測研究與GMA的甲基丙烯酸化反應(yīng)是否成功進行，從而量化甲基丙烯酸酯基團對伯胺的取代度（DS）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DS等于67%±3%。之后，為進行預(yù)交聯(lián)，對甲基丙烯酸酯蠶絲纖維素（Sil-Ma）進行光交聯(lián)，從而形成不完全共價交聯(lián)凝膠（PC）。酶促交聯(lián)（EC）取決于許多變量，如溫度、自由基、蠶絲濃度、過氧化物濃度以及蠶絲分子量，因此在用作預(yù)交聯(lián)工藝時會出現(xiàn)差異。考慮到蠶絲纖維素的氨基酸組成，酪氨酸約占總量的5%，酪氨酸內(nèi)鍵可形成高度穩(wěn)定、富有彈性的水凝膠。為研究雙交聯(lián)（DC）方法是否可進行打印，并驗證酶交聯(lián)（EC）是否會導(dǎo)致完全凝膠化，進行流變學(xué)分析。為評估可打印性，對不同成分進行粘彈性研究。比較了雙交聯(lián)（DC）和光交聯(lián)前條件（PC），并添加完全光交聯(lián)凝膠（FC）和完全酶交聯(lián)凝膠（EC）作為對照。所有條件都具有粘彈性特性，G′高于G''。15mB預(yù)交聯(lián)產(chǎn)生可擠出的均勻長絲，而其他條件則會導(dǎo)致噴嘴堵塞、異質(zhì)凝膠化（如EC）和更高擠出壓力。主要因為與15mB Sil-Ma相比，30mB Sil-Ma的分子量較低。分子量越低，鏈的纏結(jié)和長度就越少，從而影響動力學(xué)。因此，光交聯(lián)效率取決于蠶絲的分子量和濃度，與高分子量制備的Sil-Ma相比，會產(chǎn)生較弱的凝膠。不過，雖然在30mB分子量的情況下，所有條件都出現(xiàn)一個流動點，但擠壓EC和FC所需的高壓及其在重復(fù)試驗中的變化，使預(yù)交聯(lián)條件的選擇變得明確、可重復(fù)，并產(chǎn)生更均勻的絲線。

圖3 雙交聯(lián)工藝（DC）打印參數(shù)及結(jié)構(gòu)分析

研究粘彈性特性后，在LVE區(qū)域進行長時間流變測試，結(jié)果表明，預(yù)交聯(lián)形成的預(yù)凝膠具有較低的儲存模量。相比之下，將這種預(yù)凝膠與HRP交聯(lián)（雙交聯(lián)DC）結(jié)合在一起會形成一種均勻的水凝膠，與前一種條件相比，G'明顯更高。在所有參數(shù)中，凝膠化主要受蠶絲分子量和濃度影響。酶有一個初始延遲階段，在這一階段檢測不到凝膠化，蛋白質(zhì)仍然是液態(tài)的。然后，酪氨酸鍵形成，接著是鏈間蛋白質(zhì)交聯(lián)。隨著時間推移，這些動力學(xué)過程會導(dǎo)致進一步聚合，直到酪氨酸鍵完全共價形成。雙交聯(lián)條件（DC）下的儲存模量在72小時內(nèi)有所增加。PC條件并沒有隨著時間的推移而出現(xiàn)顯著變化，以上結(jié)果證實，預(yù)交聯(lián)不足以形成穩(wěn)定的均質(zhì)凝膠，而雙交聯(lián)則能形成適當?shù)哪�膠。流變分析結(jié)果表明，全交聯(lián)凝膠（酶解交聯(lián)、光固化交聯(lián)和雙交聯(lián)凝膠）需要高壓才能擠出，而且PC不足以形成穩(wěn)定的水凝膠，第二次原位酶解交聯(lián)是進一步誘導(dǎo)聚合物鏈之間共價凝膠化的必要步驟。因此，在進行三維打印時，先進行預(yù)光交聯(lián)，然后在原位激活酶交聯(lián)。

圖4 細胞在水凝膠中培養(yǎng)特性分析

圖5 使用25G噴嘴在皮膚表面進行雙交聯(lián)Sil-Ma原位打印

將骨髓間充質(zhì)干細胞接種在樣品上后，對其代謝活性和細胞粘附性進行分析。所有條件都支持細胞存活7天以上。在1-7天，檢測到細胞代謝活性明顯增加，不同測試條件和不同分子量之間沒有明顯差異。對細胞在基質(zhì)上粘附情況進行分析顯示。第 天，細胞傾向于相互影響，形成細胞簇，并出現(xiàn)一些突起。培養(yǎng)7天后，細胞在所有條件下都呈現(xiàn)拉長、伸展的形狀。蠶絲纖維素的氨基酸組成以及地形、孔隙率、刺激和硬度等因素對細胞在三維材料上的行為至關(guān)重要。預(yù)交聯(lián)（PC）和雙交聯(lián)（DC）條件下細胞粘附力和細胞形狀沒有任何差異，表明細胞與材料相互作用的驅(qū)動力可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)重排。接著從體內(nèi)應(yīng)用角度出發(fā)，在皮膚表面進行雙交聯(lián)條件下的3D打印，研究擠出墨水是否粘附在基底上。結(jié)果顯示Sil-Ma墨水附著在皮膚上倒轉(zhuǎn)基底時沒有發(fā)生脫落。蠶絲纖維素因其氨基酸組成而具有粘合特性，蠶絲氨酸極性側(cè)鏈通過形成氫鍵在與基質(zhì)相互作用方面起關(guān)鍵作用。這些相互作用也可歸因于預(yù)交聯(lián)階段不完全凝膠化，從而產(chǎn)生粘性預(yù)凝膠，通過在原位完成凝膠化，使凝膠在組織內(nèi)實現(xiàn)物理交聯(lián)。總之，以上研究結(jié)果表明，蠶絲纖維素可通過結(jié)合兩種不同交聯(lián)過程（包括光交聯(lián)和酶交聯(lián)）來滿足原位3D打印要求。此外，3D打印后水凝膠表征為進一步優(yōu)化打印形狀以更好模擬組織復(fù)雜性提供有價值的數(shù)據(jù)。

總結(jié)與展望
本文開發(fā)了用于原位3D打印基于蠶絲纖維素的生物墨水。該工藝的多功能性在兩種不同分子量蠶絲纖維素上得到驗證，通過調(diào)整制造工藝（即光照時間），原位3D打印得以實現(xiàn)。此外，研究人員開發(fā)了一種雙重交聯(lián)工藝，通過不完全光交聯(lián)進行的預(yù)凝膠化與HRP驅(qū)動的原位凝膠化相結(jié)合。使得水凝膠在介質(zhì)和水中都能保持穩(wěn)定，在有X、IV型蛋白酶存在的兩周內(nèi)實現(xiàn)降解。此外，噴嘴中擠壓應(yīng)力誘導(dǎo)的物理交聯(lián)作用導(dǎo)致無規(guī)線圈向β片狀結(jié)構(gòu)快速轉(zhuǎn)變，從而在水和介質(zhì)膨脹過程中提供穩(wěn)定性。雖然PC和DC都是原位凝膠形成的良好候選材料，但它們之間的主要區(qū)別在于后者酶促共價交聯(lián)的協(xié)同效應(yīng)。一方面，共價鍵不會影響蠶絲的二級結(jié)構(gòu)，另一方面，與預(yù)交聯(lián)水凝膠相比，共價誘導(dǎo)的水凝膠在蛋白酶作用下更耐降解。表明蠶絲纖維素生物墨水特性可根據(jù)最終應(yīng)用進行調(diào)整。使用的墨水濃度都較低，但通過共價交聯(lián)與物理交聯(lián)相結(jié)合，獲得的水凝膠在壓縮模量和膨脹性上都十分優(yōu)異。這簡化了制造過程，避免蠶絲纖維素濃度調(diào)整等步驟，從而提高凝膠結(jié)果的一致性。該生物墨水未來將進一步促進體內(nèi)原位3D打印研究的進展。

文章來源：
https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.01.015