《Nature Nanotechnology》：基于氟化彈性體的3D時(shí)空可擴(kuò)展活體神經(jīng)探針

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繪制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的長(zhǎng)期穩(wěn)定活動(dòng)圖對(duì)于神經(jīng)科學(xué)、解決神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及開(kāi)發(fā)用于神經(jīng)義肢和通信的高帶寬腦機(jī)接口都非常重要。然而，繪制神經(jīng)活動(dòng)圖具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)的功能不僅在數(shù)月或數(shù)年內(nèi)跨越多個(gè)區(qū)域和組織深度，而且還涉及需要在毫秒和微米尺度上量化單個(gè)神經(jīng)元的電活動(dòng)。在現(xiàn)有技術(shù)中，植入式微電極陣列可同時(shí)測(cè)量數(shù)千個(gè)單個(gè)神經(jīng)元的毫秒級(jí)細(xì)胞外動(dòng)作電位。通過(guò)3D堆疊或集成 CMOS（互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體）多路復(fù)用電路，可進(jìn)一步增加電極數(shù)量。然而，由于植入電極與腦組織之間存在巨大的機(jī)械和結(jié)構(gòu)差異，探針漂移、慢性組織損傷和免疫反應(yīng)限制了它們?cè)陂L(zhǎng)期穩(wěn)定記錄同一神經(jīng)元電活動(dòng)方面的時(shí)間擴(kuò)展性。記錄神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)活動(dòng)的電子設(shè)備需要在大空間和時(shí)間尺度上具有可擴(kuò)展性，同時(shí)還要提供毫秒級(jí)和單細(xì)胞的時(shí)空分辨率。然而，由于傳感器密度和機(jī)械靈活性之間的權(quán)衡，現(xiàn)有的高分辨率神經(jīng)記錄設(shè)備無(wú)法同時(shí)實(shí)現(xiàn)空間和時(shí)間層面的可擴(kuò)展性。

來(lái)自美國(guó)哈佛大學(xué)的劉嘉團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種基于全氟介電彈性體和組織級(jí)的具有柔性多層電極的3D堆疊植入式電子平臺(tái)，它能在神經(jīng)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)時(shí)空可擴(kuò)展的單細(xì)胞神經(jīng)電生理學(xué)。本研究的彈性體在生理溶液中可保持一年以上的穩(wěn)定介電性能，其柔軟度是傳統(tǒng)塑料介電材料的 10,000 倍。利用這些獨(dú)特的特性，本研究開(kāi)發(fā)出了以3D配置封裝光刻納米厚電極陣列的方法，其橫截面密度為每 100 μm2 7.6 個(gè)電極。由此產(chǎn)生的3D集成多層軟電極陣列保持了組織級(jí)的靈活性，減少了小鼠神經(jīng)組織中的慢性免疫反應(yīng)，并證明有能力在不干擾動(dòng)物行為的情況下可靠地跟蹤小鼠大腦或脊髓中長(zhǎng)達(dá)數(shù)月的電活動(dòng)。相關(guān)工作以題為“3D spatiotemporally scalable in vivo neural probes based on fluorinated elastomers”的文章發(fā)表在2023年12月22日的國(guó)際頂級(jí)期刊《Nature Nanotechnology》。

【通訊作者簡(jiǎn)介】

哈佛大學(xué)劉嘉課題組的目標(biāo)是通過(guò)各種尺度將電子學(xué)與生物學(xué)結(jié)合起來(lái)。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，本課題組匯集了生物工程、電子工程、化學(xué)、生物信息學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)以及材料科學(xué)和機(jī)械工程等領(lǐng)域的專家，利用納米電子學(xué)、軟材料和基因工程與半導(dǎo)體工業(yè)兼容的光刻技術(shù)相結(jié)合，開(kāi)發(fā)可擴(kuò)展的生物電子學(xué)平臺(tái)技術(shù)。課題組的目標(biāo)是將這些可擴(kuò)展的生物電子技術(shù)與機(jī)械人工程、單細(xì)胞基因組學(xué)、成像和計(jì)算分析相結(jié)合，將電子學(xué)與生物學(xué)無(wú)縫結(jié)合，將機(jī)器智能與自然智能融為一體。利用這一平臺(tái)技術(shù)，本課題組開(kāi)發(fā)出能夠跟蹤和控制活生物體和行為動(dòng)物體內(nèi)單個(gè)細(xì)胞多模式活動(dòng)的工具，這些活動(dòng)具有細(xì)胞類型特異性，可跨時(shí)間和空間對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。利用本課題組專業(yè)的實(shí)驗(yàn)和計(jì)算知識(shí)，旨在了解單細(xì)胞多模式生理學(xué)和基因表達(dá)的群體動(dòng)態(tài)與整個(gè)器官和生物體的功能和功能障礙之間的關(guān)系。本課題組的研究涉及腦機(jī)接口、神經(jīng)工程、干細(xì)胞工程、心臟疾病和發(fā)育障礙等領(lǐng)域的問(wèn)題。2022年，劉嘉入選《麻省理工科技評(píng)論》“35歲以下科技創(chuàng)新35人”全球榜單。

1. 創(chuàng)新型研究?jī)?nèi)容
本研究通過(guò)3D集成薄膜組織級(jí)軟微電極陣列（圖 1b），推出了一種時(shí)空可擴(kuò)展的神經(jīng)探針（圖 1a）。本研究克服了軟介電彈性體在生理溶液中作為鈍化層的內(nèi)在不穩(wěn)定性，使用了具有高疏水和低分子溶解度的含氟彈性體，這大大減少了來(lái)自周圍生物流體的離子擴(kuò)散，從而實(shí)現(xiàn)了在生物流體中長(zhǎng)期穩(wěn)定的介電性能。具體來(lái)說(shuō)，本研究開(kāi)發(fā)了一種基于全氟聚醚 (PFPE) 的彈性體，作為一種彈性光圖案介電材料。這種基于全氟聚醚（PFPE）的光圖案介電材料（1）比傳統(tǒng)的硬塑料封裝材料柔軟 10,000 倍，同時(shí)保持相同水平的縱向介電性能；（2）能夠進(jìn)行微米分辨率的3D光刻多層納米制造；（3）與納米級(jí)厚度的金屬沉積工藝相兼容。3D堆疊微電極陣列可以通過(guò)3D堆疊增加電極的數(shù)量和密度，同時(shí)保持組織級(jí)的靈活性和機(jī)械堅(jiān)固性，并能在數(shù)月內(nèi)以單機(jī)-單尖峰分辨率穩(wěn)定跟蹤電活動(dòng)，同時(shí)減少免疫反應(yīng)，這證明了其在神經(jīng)電生理學(xué)的空間和時(shí)間尺度上的可擴(kuò)展性（圖 1c）。

本研究的設(shè)計(jì)基于以下理由。在不改變探針柔性特性的前提下增加電極密度的方法之一是大幅縮小互連尺寸。然而，這會(huì)帶來(lái)串?dāng)_和信號(hào)衰減等挑戰(zhàn)。另一種方法是使用薄膜晶體管進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)多路復(fù)用以增加電極密度，但其機(jī)械剛性和在生理溶液中需要較厚的無(wú)機(jī)鈍化層限制了其在組織級(jí)柔性神經(jīng)探針中的應(yīng)用潛力。第三種方法是通過(guò)垂直堆疊3D電極陣列來(lái)增加電極密度（圖 1d），但這需要采用低模量電子材料來(lái)保持整體靈活性。

圖1 用于時(shí)空可擴(kuò)展體內(nèi)電生理學(xué)的植入式神經(jīng)探針

【生物流體中長(zhǎng)期穩(wěn)定的軟封裝】
傳統(tǒng)的介電彈性體可用作生物電子學(xué)的軟封裝材料；然而，由于生理溶液中的離子會(huì)逐漸滲透到彈性體中，它們的長(zhǎng)期封裝性能受到了限制（圖 1h,i）。本研究團(tuán)隊(duì)之前的研究表明，它們的電化學(xué)阻抗在生物液體中會(huì)急劇下降，從而降低封裝電極的截止頻率。這種不穩(wěn)定性主要是由生物流體中的離子擴(kuò)散到彈性體中造成的（圖 2a），因?yàn)檐浘酆衔锏姆肿訚B透性通常比塑料和無(wú)機(jī)物的分子滲透性高幾個(gè)數(shù)量級(jí)。聚合物的離子傳導(dǎo)性與其擴(kuò)散性和溶解性成正比。本研究利用分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬研究了水和氯化鈉在不同介電彈性體中的擴(kuò)散，以更好地理解這一離子擴(kuò)散過(guò)程，并確定可能解決這一問(wèn)題的材料系統(tǒng)。本研究的 MD 模擬顯示，在 37℃時(shí)，含氟彈性體（PFPE-DMA 和 PHFIPA）中水、鈉離子和氯離子的分子擴(kuò)散率低于傳統(tǒng)彈性體（PDMS 和 H-SEBS）（圖 2b）。這種較低的擴(kuò)散率表明，含氟彈性體的離子傳導(dǎo)率可能低于傳統(tǒng)彈性體，這可能使它們?cè)谏�理溶液中長(zhǎng)期浸泡時(shí)保持介電性能。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究系統(tǒng)分析了八種不同介電材料的長(zhǎng)期電化學(xué)穩(wěn)定性，其中包括三種含氟彈性體（PFPE-DMA、PHFIPA 和聚[2-(全氟己基)乙基]丙烯酸酯 (PPFHEA)）、三種非含氟彈性體（PDMS、H-SEBS 和聚異丁烯 (PIB)）以及作為對(duì)照的兩種塑料介電聚合物（聚酰亞胺 (PI) 和 SU-8 2000.5 (SU-8)）。

本研究使用電化學(xué)阻抗光譜（EIS）和外部電解質(zhì)電導(dǎo)測(cè)量（EEC）技術(shù)評(píng)估了介電聚合物的離子電導(dǎo)率（圖 2c）。本研究使用具有導(dǎo)電損耗的電介質(zhì)材料電學(xué)模型，根據(jù) EIS 數(shù)據(jù)估算離子電導(dǎo)率。為了進(jìn)行加速老化試驗(yàn)，本研究將聚合物薄膜浸泡在 10 倍 PBS 溶液中，溫度為 70℃。浸泡前后歸一化電化學(xué)阻抗 (Z) 的 Bode 圖顯示，在 0-1,000 Hz 范圍內(nèi)，傳統(tǒng)彈性體和 PI 薄膜的阻抗大幅降低，而 SU-8 和含氟彈性體薄膜的阻抗則略有降低。在低頻（<1,000 赫茲）下，所有含氟彈性體薄膜的阻抗模量降幅都低于 PDMS、H-SEBS、PIB 和 PI 薄膜。為了考慮由于樣品厚度不同而導(dǎo)致的擴(kuò)散時(shí)間變化，本研究繪制了 1 Hz 和 1 kHz 時(shí)阻抗模量的逐漸減小曲線（圖 2d），作為時(shí)間（t）與聚合物薄膜平均厚度（H）平方的歸一化函數(shù)。在 1 Hz 時(shí)，非氟化彈性體的歸一化阻抗下降幅度更大。此外，本研究還從 EIS 圖中推斷出介質(zhì)薄膜在 1,000-100,000 Hz 頻率范圍內(nèi)的平均介電常數(shù)，證實(shí) PFPE-DMA 的介電常數(shù)較低（ε = 1.99 ± 0.03），與之前的報(bào)告一致。

圖2 作為軟性長(zhǎng)壽命電介質(zhì)的氟化彈性體

【3D可擴(kuò)展神經(jīng)探針】
本研究開(kāi)發(fā)了一種使用全氟聚醚-DMA 彈性體的3D光刻技術(shù)，并且將其用于可擴(kuò)展的神經(jīng)探針制造。傳統(tǒng)的彈性體不適合多層光刻技術(shù)，因?yàn)樵诖诉^(guò)程中使用的有機(jī)溶劑容易導(dǎo)致彈性體膨脹，從而損壞薄膜微結(jié)構(gòu)和微電子元件。然而，PFPE-DMA 彈性體已顯示出化學(xué)正交性，既能抵抗有機(jī)溶劑，也能抵抗水性溶劑，即使在密集的納米加工后仍能保持其表面。然而，與其他傳統(tǒng)光圖案化介電材料的高接觸角以及與金屬的低表面粘附能阻礙了在 PFPE-DMA 彈性體上直接圖案化金屬。此外，交聯(lián)過(guò)程中對(duì)氧氣的敏感性也限制了基于掩模的 PFPE-DMA 彈性體光刻圖案的分辨率。

為了克服這些挑戰(zhàn)，本研究開(kāi)發(fā)了以下先進(jìn)技術(shù)：(1)可3D打印的氮?dú)鈹U(kuò)散器與傳統(tǒng)光刻機(jī)集成，在紫外線（UV）照射期間形成惰性氣氛，從而實(shí)現(xiàn) PFPE-DMA 的微尺度光刻；(2) 光刻隔板可防止 PFPE-DMA 前驅(qū)體與光罩直接接觸，從而在光刻過(guò)程中保持 PFPE-DMA 薄膜的納米級(jí)平滑度；（3）用惰性氣體等離子體處理，以減小光刻膠的接觸角，增加與其他材料的附著力；以及（4）高壓濺射金屬氧化物/金屬層，以沉積金屬線，防止金屬離子擴(kuò)散到 PFPE-DMA 中�？梢灾貜�(fù)(1)-(4)工序來(lái)制造多層微電子結(jié)構(gòu)。重要的是，這些創(chuàng)新技術(shù)使 PFPE-DMA 能夠在標(biāo)準(zhǔn)潔凈室中作為負(fù)光刻電介質(zhì)材料進(jìn)行加工，從而使 PFPE-DMA 成為一種可與 3D 電子產(chǎn)品的傳統(tǒng)光刻工藝兼容的彈性體（圖 3a）。

圖 3b 顯示了玻璃毛細(xì)管上帶有 64 個(gè)電極的神經(jīng)探針的靈活性。相應(yīng)的明場(chǎng)（BF）光學(xué)圖像顯示一個(gè)探針包含六層 PFPE-DMA 夾層四層金屬電極（圖 3c、d）。掃描電子顯微鏡（SEM）成像用于確認(rèn)十層制造工藝后 PFPE-DMA 介電層的光滑表面。本研究對(duì) PFPE-DMA 特征的橫向分辨率達(dá)到了約 1 μm，表面處理使標(biāo)準(zhǔn)光刻膠能夠在 PFPE-DMA 薄膜上確定精確的特征。值得注意的是，即使單軸拉伸到 20%，PFPE-DMA 和金屬層之間也沒(méi)有分層（圖 3e）。粘附測(cè)試表明，PFPE-DMA 層的自粘附能大大高于其與玻璃基底的粘附能，并且更接近于所測(cè)得的固有斷裂韌性，這表明兩個(gè) PFPE-DMA 層粘附牢固，在應(yīng)變下不易分層。在單軸拉伸大于 20% 后，64 通道四金屬層神經(jīng)探針上未觀察到層間分層現(xiàn)象。此外，在生理鹽水中加速老化也不會(huì)誘發(fā)全氟聚醚-DMA 和金屬層之間的分層。

圖3 3D集成高密度軟微電極陣列，實(shí)現(xiàn)可擴(kuò)展的神經(jīng)探針

【長(zhǎng)期穩(wěn)定的神經(jīng)電生理學(xué)】
本研究將神經(jīng)探針植入小鼠大腦進(jìn)行長(zhǎng)期記錄。軟神經(jīng)探針是按照傳統(tǒng)的方法送入大腦的。PFPE-DMA 探針垂直整合了四層電極陣列，橫截面積約為超柔性探針的 150-500 倍，因此可以在一個(gè)探針中高密度植入 64 個(gè)電極（圖 4a）。本研究比較了多層 PFPE-DMA 探針和相同厚度的 SU-8 探針的腦免疫反應(yīng)（圖 4b、c）。在植入后 12 周，觀察到與 SU-8 探頭相比，PFPE-DMA 探頭周圍的 NeuN（神經(jīng)元）信號(hào)明顯增強(qiáng)。此外，與 SU-8 探針相比，植入后 12 周 PFPE-DMA 探針周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯降低。然而，小膠質(zhì)細(xì)胞信號(hào)的差異微乎其微。這些結(jié)果表明，3D垂直堆疊多層 PFPE-DMA 探針能與腦組織保持長(zhǎng)期的生物相容性。慢性記錄（圖 4d、e）顯示，在十周的植入期內(nèi)，單個(gè)單元?jiǎng)幼麟娢坏挠涗浄浅７�(wěn)定，棘間期（ISI）分布（圖 4f）和波形形狀（圖 4g）的變化極小。此外，主成分分析（PCA）顯示，從植入后兩周到十周，所有單元在第一和第二主成分平面（PC1-PC2）上的位置幾乎保持不變（圖 4h）。此外，振幅、點(diǎn)燃率和波形相似性在所有記錄過(guò)程中都保持不變，這表明高密度多層軟探針可以長(zhǎng)期穩(wěn)定地跟蹤來(lái)自相同神經(jīng)元的活動(dòng)（圖 4-i-k）。本研究還使用帶有單層電極陣列（約 2 微米厚的 PFPE-DMA）的 PFPE-DMA 探頭證實(shí)了腦記錄的穩(wěn)定性，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了超薄 PFPE-DMA 封裝層在長(zhǎng)期腦記錄過(guò)程中的介電穩(wěn)定性。

圖4 通過(guò)可擴(kuò)展的軟神經(jīng)探針實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定的腦電生理和植入，同時(shí)減少免疫反應(yīng)

PFPE-DMA 介電層的可拉伸性使多層神經(jīng)探針能夠承受更大的應(yīng)變，在彎曲過(guò)程中對(duì)組織造成的機(jī)械損傷更小。為了證明這一點(diǎn)，本研究對(duì)小鼠脊髓進(jìn)行了慢性電生理學(xué)研究（圖 5a）。首先比較了 PFPE-DMA 和 PI 探針與假手術(shù)對(duì)照組的免疫反應(yīng)，從而確定了長(zhǎng)期免疫反應(yīng)的特征（方法）。厚度為 25 μm 的 PI 探針被用作柔性脊髓植入物的標(biāo)準(zhǔn)探針，其堅(jiān)固程度足以承受手術(shù)過(guò)程和長(zhǎng)期植入。假手術(shù)組動(dòng)物接受脊髓手術(shù)，但未植入裝置。通過(guò)檢測(cè)異物反應(yīng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP）和小膠質(zhì)細(xì)胞（IBA1）的密度來(lái)評(píng)估慢性階段的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，結(jié)果顯示，在植入后六周，PI 探針附近的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞密度增加。相比之下，植入 PFPE-DMA 探針的小鼠與假手術(shù)動(dòng)物沒(méi)有明顯差異（圖 5b、c）。

本研究通過(guò)測(cè)量小鼠在開(kāi)闊地箱中的自由移動(dòng)以及在水平梯子上基本行走和熟練運(yùn)動(dòng)時(shí)的全身運(yùn)動(dòng)情況，確定了植入探針對(duì)動(dòng)物行為的影響（圖 5d）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，與假對(duì)照組相比，植入 PI 探針的小鼠在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的平均距離和平均速度都有所減少，同時(shí)還出現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)障礙，而植入 PFPE-DMA 探針的小鼠則沒(méi)有明顯差異（圖 5e）。利用植入的電極，本研究記錄了幾周內(nèi)來(lái)自代表性電極的尖峰樣電活動(dòng)（圖 5f），其發(fā)射率的變化與動(dòng)物的靜息和行走狀態(tài)相對(duì)應(yīng)（圖 5g、h）。觀察到的尖峰表現(xiàn)為持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)（2-4 毫秒）和振幅增大（250-500 微伏）。這種現(xiàn)象以前在小鼠脊髓深度探針記錄中也曾出現(xiàn)過(guò)。然而，要確定這些尖峰是多單位動(dòng)作電位還是局部場(chǎng)電位，還需要進(jìn)一步研究。這些結(jié)果表明，植入小鼠脊髓的 PFPE-DMA 軟神經(jīng)探針不會(huì)影響動(dòng)物的行為，并能穩(wěn)定記錄脊髓電活動(dòng)。

圖5 長(zhǎng)期穩(wěn)定的脊髓記錄

2. 總結(jié)與展望
本研究表明，可以用四層氟化彈性體/金屬結(jié)構(gòu)制作神經(jīng)探針。基于歐拉-伯努利梁理論的分析模型顯示，多達(dá)九層的探針彎曲剛度低于 1 μN(yùn) m，而由塑料電介質(zhì)封裝的探針只有三層電極，彎曲剛度高于 1 μN(yùn) m。在實(shí)踐中，厚度超過(guò) 10 微米的塑料探針會(huì)變脆，而由彈性體封裝的探針在植入時(shí)則會(huì)保持柔韌性和堅(jiān)固性。研究表明，與薄的硬塑料探針相比，橫截面更大的超軟神經(jīng)探針可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定的神經(jīng)記錄。這些超軟探針可以支持更多通道。本研究發(fā)現(xiàn)，金層和全氟聚醚-DMA 層之間的極度模量不匹配可能會(huì)導(dǎo)致中性軸的分裂，從而降低彎曲剛度。不過(guò)，基于以前工作的分析模型表明，歐拉-伯努利理論仍然適用于探針的大部分長(zhǎng)度。實(shí)際上，擴(kuò)展這些探針的主要限制可能來(lái)自微加工方面的挑戰(zhàn)。當(dāng)介質(zhì)層的彈性模量低于兆帕斯卡水平時(shí)，它對(duì)探針總撓曲剛度的貢獻(xiàn)微乎其微，金屬層在探針的機(jī)械性能中占主導(dǎo)地位。因此，隨著層數(shù)的增加，優(yōu)勢(shì)也會(huì)逐漸減少，因?yàn)殡x中軸較遠(yuǎn)的金屬層對(duì)探針撓曲剛度的貢獻(xiàn)更大。為了降低這種剛性，可以考慮采取一些策略，例如調(diào)整金屬層的位置、增加外層彈性體厚度以防止信號(hào)泄漏或使用液態(tài)金屬等較軟的導(dǎo)體。

文章來(lái)源：
https://www.nature.com/articles/s41565-023-01545-6
https://liulab.seas.harvard.edu/