《Biofabrication》：新型3D打印雙層多孔水凝膠支架用于軟骨--骨整合修復(fù)

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軟骨和骨的整體修復(fù)涉及到細(xì)胞的遷移和分化，這一直是一個(gè)難以解決的難題。暨南大學(xué)郭瑞副研究員和Zejian Li利用天然生物材料明膠構(gòu)建了甲基丙烯�；�明膠（GelMA），一種具有高度細(xì)胞親和力的水凝膠支架。將GelMA與不同成分混合，通過(guò)三維（3D）打印技術(shù)，在上、下層分別打印出不同模量和組成的雙層多孔水凝膠支架。上層支架在GelMA中添加黑磷（BP）和人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUMSCs）外泌體（exos），其具有相對(duì)較低的彈性模量，有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）向軟骨分化。在下層支架中，除了BP和hUMSCs外，將具有骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)作用的β-磷酸三鈣（β-TCP）添加到GelMA中。β-TCP的加入顯著提高水凝膠支架的彈性模量，有利于BMSCs的成骨分化。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，雙層支架分別能促進(jìn)成骨和軟骨分化。兔軟骨-骨損傷模型中，MRI和顯微CT結(jié)果顯示，3D打印雙層GelMA復(fù)合支架具有接近正常組織的修復(fù)效果。

相關(guān)研究?jī)?nèi)容以“Novel 3D-printing bilayer GelMA-based hydrogel containing BP,β-TCP and exosomes for cartilage–bone integrated repair”為題于2023年31日發(fā)表在《Biofabrication》。

圖1 GelMA的化學(xué)成分及打印能力

1H NMR譜顯示，在GelMA上出現(xiàn)甲基丙烯酸酯的特征官能團(tuán)（圖1A），證明成功合成GelMA。在GelMA/β-TCP凍干水凝膠支架的XRD模式中觀察到β-TCP的特征峰（圖1B）。BP的透射電鏡圖像顯示橫向尺寸約為200 nm的層狀結(jié)構(gòu)（圖1C）。DLS結(jié)果表明，BP的平均水化粒徑約為500nm（圖1D）。隨著溫度的升高，不同比例的β-TCP復(fù)合油墨凝膠-溶膠溫度基本相同，且低于GelMA，同時(shí)GelMA油墨在冷卻過(guò)程中的凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變溫度最大（圖1E-H）。油墨通過(guò)噴嘴擠壓，在5℃下與基板接觸，形成一個(gè)弱凝膠狀態(tài)的3D打印支架，然后為了保證支架的長(zhǎng)期結(jié)構(gòu)完整性，探索了油墨的光交聯(lián)性能（圖1I-L）。在365 nm紫外光照射10 s后，油墨處于凝膠狀態(tài)，存儲(chǔ)能量和損耗模量趨于穩(wěn)定。因此在打印后紫外照射下獲得具有較高結(jié)構(gòu)完整性和力學(xué)性能的支架。

圖2 GelMA復(fù)合水凝膠支架的物理性能及細(xì)胞粘附性

本研究使用擠壓3D打印機(jī)成功地將上述幾種生物墨水打印到3D網(wǎng)格支架中（圖2A）。應(yīng)力-應(yīng)變曲線如圖2B所示。通過(guò)添加1%和3%的β-TCP，GelMA/β-TCP的楊氏模量顯著增加，且所有水凝膠材料在12 h左右達(dá)到溶脹平衡（圖2C）。接著研究了該材料在含和不含溶菌酶的PBS溶液中的降解性能（圖2D、E）。GelMA/β-TCP復(fù)合水凝膠在溶菌酶和無(wú)溶菌酶PBS溶液中的剩余重量均小于GelMA水凝膠。掃描電鏡圖像顯示無(wú)論縱截面還是表面，都顯示出有利于材料交換的多孔結(jié)構(gòu)（圖2F）。F-actin染色圖像顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的高面積覆蓋指數(shù)和細(xì)胞連通性（圖2G）。圖2H顯示了GelMA復(fù)合水凝膠支架上的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活/死染色。BMSC均勻地存在于支架網(wǎng)格上，大部分細(xì)胞為綠色，染色后僅有相對(duì)較少的細(xì)胞為紅色，說(shuō)明BMSCs在支架上的存活率較高。因此GelMA/BExo和GelMA/β-TCP/BExo支架在骨和軟骨生長(zhǎng)過(guò)程中具有良好的生物相容性，對(duì)BMSCs無(wú)細(xì)胞毒性。

圖3 體外成軟骨分化

體外培養(yǎng)14 d、21 d后，不同組成的GelMA支架呈現(xiàn)出不同程度的藍(lán)色（圖3A）。定量分析GAG含量發(fā)現(xiàn)，GelMA/BExo支架上的GAGs含量顯著高于GelMA/BP和GelMA/Exo支架（圖3B、C）。Sox9是調(diào)控軟骨分化的主要基因，COL 2a1基因編碼Col II α1鏈，三個(gè)相同的α1鏈形成Col II，這是透明軟骨的主要成分。Acan編碼聚合。圖3D-F顯示與軟骨生成分化相關(guān)的三個(gè)典型基因的表達(dá)含量。上述三個(gè)基因編碼的蛋白表達(dá)水平與基因表達(dá)水平的變化趨勢(shì)相似。圖3G為三個(gè)基因編碼的蛋白表達(dá)的WB圖像，量化數(shù)據(jù)如圖3H-J所示。以上結(jié)果表明，在軟骨修復(fù)層中，BP和MSC外顯子降解后產(chǎn)生的磷酸鹽可能共同影響軟骨細(xì)胞的增殖、代謝、基因表達(dá)和礦化前過(guò)程，從而實(shí)現(xiàn)軟骨再生。

圖4 體外成骨分化

將BMSCs與GelMA復(fù)合支架共培養(yǎng)14 d、21 d后，用茜素紅染色法對(duì)成骨細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行染色（圖4A）。共培養(yǎng)GelMA復(fù)合支架第14、21天茜素紅染色的定量結(jié)果顯示，GelMA/BExo//GelMA/β-TCP/BExo水凝膠支架成骨顯著，其次是GelMA/BExo水凝膠支架（圖4B、C）。BP可以增強(qiáng)OCN基因和蛋白的表達(dá)，GelMA/BP組的基因表達(dá)水平甚至與含β-TCP組更接近（圖4D）。RUNX2基因在GelMA/BExo//GelMA/β-TCP/BExo水凝膠支架組中表達(dá)量最高，顯著高于GelMA組（圖4E）。在含有β-TCP的水凝膠中，col1a2的基因表達(dá)量較高，而在GelMA/BExo組中則保持在較低水平（圖4F）。成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)與基因表達(dá)趨勢(shì)接近，WB定量結(jié)果如圖4G-J所示。以上結(jié)果表明在GelMA水凝膠支架中加入β-TCP可顯著增強(qiáng)成骨分化。

圖5 兔體內(nèi)軟骨-骨再生

只有GelMA/BExo//GelMA/β- TCP/BExo組的再生軟骨外觀與周圍組織幾乎完全一致，肉眼幾乎看不到損傷邊界（圖5A）。質(zhì)子密度加權(quán)成像和3D脂肪抑制的梯度回波序列掃描的MRI結(jié)果顯示，GelMA/Exo、GelMA/BExo和GelMA/BExo//GelMA/β-TCP/BExo組有連續(xù)的關(guān)節(jié)軟骨，但GelMA/Exo組的軟骨表面不如其他兩組光滑（圖5G）。T2作圖結(jié)果顯示，GelMA/BExo//GelMA/β-TCP/BExo組顯著低于其他組（圖5F），表明軟骨損傷程度較低。micro-CT3D重建結(jié)果顯示，損傷部位骨量較6周時(shí)明顯增加，愈合趨勢(shì)保持一致（圖5B）。在GelMA/BExo//GelMA/β-TCP/BExo組中，除了冠狀面和中矢狀面有連續(xù)骨組織外，橫斷面也顯示損傷部位完全充滿骨組織，而其余五組仍有圓形或橢圓形腔（圖5C）。在第14周時(shí)，GelMA/BExo//GelMA/β-TCP/BExo組的BMD達(dá)到0.3g cm−3，BV/TV達(dá)到32.5%（圖5D、E）。

圖6 治療6、14周后軟骨-骨缺損區(qū)域的組織學(xué)染色

圖7 治療6周后對(duì)損傷區(qū)域的組織學(xué)評(píng)估

圖8 治療14周后對(duì)損傷部位的組織學(xué)評(píng)估

圖6為損傷部位第6周（圖6A）和第14周（圖6B）時(shí)組織切片的全掃描圖像，用于評(píng)估組織修復(fù)和骨、軟骨的分化。在第6周時(shí)，通過(guò)H&E染色可觀察到關(guān)節(jié)軟骨和松質(zhì)骨的明顯損傷。細(xì)胞從皮質(zhì)骨遷移到關(guān)節(jié)軟骨末端，逐漸填充損傷區(qū)域。在GelMA/BExo//GelMA/β-TCP/BExo組中，觀察到關(guān)節(jié)軟骨下的松質(zhì)骨從損傷邊緣到中心逐漸閉合。14周后，GelMA/BExo//GelMA/β-TCP/BExo和GelMA/BExo損傷區(qū)域完全閉合，松質(zhì)骨小梁接近正常組織結(jié)構(gòu)。Masson染色顯示，在第6周時(shí)，GelMA/BP組的關(guān)節(jié)軟骨和松質(zhì)骨中有大量膠原沉積，而GelMA/BExo和GelMA/BExo//GelMA/β- TCP/BExo組的松質(zhì)骨中膠原含量相對(duì)較低。

損傷區(qū)域進(jìn)一步擴(kuò)大后，治療6周，對(duì)照組損傷部位幾乎未見(jiàn)軟骨細(xì)胞，而GelMA/BP組在損傷兩端有大量的軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)，接近正常組織（圖7A），并一直遷移到損傷內(nèi)部，直到材料中沒(méi)有完全降解的部分（圖7B）。GelMA/BExo和GelMA/BExo//GelMA/β- TCP/BExo水凝膠支架植入6周后，損傷部位主要由軟骨細(xì)胞填充。

14周后，GelMA/BExo//GelMA/β- TCP/BExo組的骨環(huán)結(jié)構(gòu)最清晰，厚度均勻，上軟骨細(xì)胞與下成骨細(xì)胞邊界清晰，厚度與正常組織基本相同，說(shuō)明GelMA/BExo//GelMA/β- TCP/BExo組基本實(shí)現(xiàn)軟骨-骨的整合修復(fù)。但在番紅精O-fast綠色染色中，骨環(huán)上部的紅色并不明顯（圖8A、B）。

綜上所述，在用于軟骨-骨整合修復(fù)的3D打印雙層水凝膠支架的研究中，通過(guò)改變生物墨水的組成，設(shè)計(jì)了上下兩層具有不同模量的GelMA水凝膠支架。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明，雙層GelMA/BExo//GelMA/β- TCP/BExo水凝膠支架具有促進(jìn)軟骨和骨分化的能力，軟骨修復(fù)速度最快，再生質(zhì)量最高。軟骨下骨由軟骨內(nèi)成骨形成，關(guān)節(jié)軟骨與松質(zhì)骨之間的邊界清晰，其厚度與正常組織基本相同。此外，3D打印技術(shù)可以用于定制缺損的形狀，這對(duì)于治療嚴(yán)重的軟骨損傷、骨性關(guān)節(jié)炎和其他損傷軟骨下骨的軟骨疾病是非常有潛力的。

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https://doi.org/10.1088/1758-5090/ad04fe