《Biomaterials》綜述：3D組織模型的研究進(jìn)展與臨床前應(yīng)用

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傳統(tǒng)的二維（2D）細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物相關(guān)實(shí)驗(yàn)在精確評(píng)估藥物毒性和臨床療效方面存在局限性，導(dǎo)致藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程較為困難。三維（3D）體外模型作為替代平臺(tái)應(yīng)運(yùn)而生，它能夠準(zhǔn)確模擬體內(nèi)條件，提高候選藥物臨床效果和毒性的篩選能力。研究發(fā)現(xiàn)，三維模型能準(zhǔn)確表現(xiàn)人體復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)，可廣泛用于疾病建模。生物醫(yī)學(xué)、材料和工程領(lǐng)域在制造各種三維體外模型方面取得重大進(jìn)展，與傳統(tǒng)模型相比，這些模型具有更好的疾病進(jìn)展預(yù)測(cè)能力和藥物療效，為新藥研發(fā)提供更加有效的平臺(tái)。近日，來(lái)自美國(guó)賓夕法尼亞州立大學(xué)的Ibrahim T. Ozbolat教授和贛南醫(yī)學(xué)院彭維杰教授團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了3D組織模型：生物制造技術(shù)和臨床前應(yīng)用的相關(guān)綜述。成果以“A comprehensive review on 3D tissue models: Biofabrication technologies and preclinical applications”為題于11月27日發(fā)表在《Biomaterials》上。

本綜述重點(diǎn)介紹了三維體外組織模型在臨床前應(yīng)用方面的最新進(jìn)展，包括肝臟、骨骼、胃腸道、腎臟、心臟、大腦和軟骨等多個(gè)器官和組織的藥物篩選以及疾病建模。還討論了為特定器官制造三維模型的策略及其優(yōu)勢(shì)和缺陷。此外，本文還闡述了未來(lái)建立與生理微環(huán)境相關(guān)三維模型的考慮因素，并提供了有關(guān)知識(shí)產(chǎn)權(quán)、行業(yè)發(fā)展和監(jiān)管環(huán)境的獨(dú)特視角。

圖1 利用不同細(xì)胞來(lái)源制作三維組織模型的制造過(guò)程，針對(duì)特定器官進(jìn)行疾病建模和藥物篩選

在過(guò)去幾十年中，用于疾病建模和藥物篩選等臨床前應(yīng)用的不同類(lèi)型的三維體外模型制造技術(shù)取得重大進(jìn)展。這些進(jìn)步為其在制藥領(lǐng)域的應(yīng)用帶來(lái)新機(jī)遇。本文回顧了用于藥物篩選和疾病建模的三維體外組織模型的最新進(jìn)展，這些模型適用于各種器官和組織，如圖1所示：肝臟、胃腸道、腎臟、心臟、大腦、骨骼和軟骨。本文還探討了當(dāng)前為特定器官創(chuàng)建三維模型的生物制造技術(shù)，并討論了其優(yōu)勢(shì)和局限性。

一、構(gòu)建三維組織模型的生物制造技術(shù)

與二維模型相比，三維模型的優(yōu)勢(shì)已經(jīng)得到廣泛研究，加速了三維模型生物制造技術(shù)的進(jìn)展。本節(jié)重點(diǎn)介紹開(kāi)發(fā)三維模型的各種生物制造技術(shù)，包括異細(xì)胞球、水凝膠支架、微流體、有機(jī)體、生物反應(yīng)器和三維生物打印組織，如圖2所示。

圖2 用于構(gòu)建三維組織模型的常用生物制造技術(shù)

1.1 球面模型

球狀細(xì)胞是具有強(qiáng)細(xì)胞間粘附性的細(xì)胞團(tuán)，類(lèi)似于一小塊組織，可通過(guò)各種技術(shù)進(jìn)行制造。以前球體模型是用懸滴技術(shù)培育的，這種方法可使細(xì)胞先形成細(xì)胞簇，然后聚集成小懸浮液。該技術(shù)可以在常見(jiàn)試管、玻璃和孔板中培育球體。在藥物評(píng)估領(lǐng)域，懸滴技術(shù)的主要問(wèn)題是其有限的細(xì)胞培養(yǎng)體積使藥物導(dǎo)入過(guò)程復(fù)雜化，尤其是在涉及培養(yǎng)基更換時(shí)，限制其在高通量應(yīng)用中的使用。作為一種替代方法，通過(guò)使用涂有非反應(yīng)性基底的孔板抑制細(xì)胞粘附到塑料表面，可以生產(chǎn)出更大培養(yǎng)體積的球形細(xì)胞。粘附性低的孔板可促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，促進(jìn)球狀結(jié)構(gòu)的形成。該技術(shù)通常用于研究腫瘤球體內(nèi)的藥物反應(yīng)。該技術(shù)操作簡(jiǎn)單、成本低廉、可重復(fù)性強(qiáng)、可與多種腫瘤細(xì)胞系兼容，適用于中高通量的藥物篩選。但是其靈活性受到限制，因?yàn)榍蛐渭?xì)胞可在培養(yǎng)基中自由漂浮，妨礙培養(yǎng)基的更換過(guò)程。有些細(xì)胞系由于粘附素表達(dá)受限，在低附著環(huán)境中無(wú)法自然形成球形結(jié)構(gòu)。

1.2 水凝膠支架
ECM與細(xì)胞之間的相互作用以及這種相互作用如何影響細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)變化對(duì)藥物篩選尤為重要，這促使研究人員利用類(lèi)ECM生物材料進(jìn)行三維模型的生物制造。其中，最常見(jiàn)的方法是將細(xì)胞包裹在與原生ECM特性相似的水凝膠中。根據(jù)制備水凝膠的材料來(lái)源，可分為天然水凝膠和合成水凝膠兩類(lèi)。

1.3 新興生物制造技術(shù)
基于微流控技術(shù)的微生理系統(tǒng)以及器官芯片技術(shù)一直是制造三維模型的先進(jìn)平臺(tái)。這些技術(shù)可以控制細(xì)胞之間的相互作用以及ECM與細(xì)胞之間的相互作用，并實(shí)現(xiàn)灌注功能，但要將細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-ECM之間的相互作用應(yīng)用于微孔板的高通量篩選工具則具有挑戰(zhàn)性。與此相反，三維生物打印作為一種創(chuàng)建高通量三維模型的技術(shù)已經(jīng)較為成熟，能夠加入可調(diào)ECM成分以模擬體內(nèi)條件。這些特點(diǎn)使該技術(shù)尤其適合藥物篩選。

圖3 用于構(gòu)建三維組織模型生物制造技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

二、用于藥物篩選和建立疾病模型的三維組織模型

2.1 肝臟
肝臟是維持體內(nèi)平衡的主要器官，在氨基酸、脂類(lèi)、異源物代謝、蛋白質(zhì)、葡萄糖、凝血因子和膽汁生成方面發(fā)揮重要作用。在過(guò)去十年中，許多研究工作都集中在肝臟模型的開(kāi)發(fā)上，這些模型可模擬肝臟功能。用于研究肝臟疾病相關(guān)機(jī)制和藥物的影響。二維培養(yǎng)的原代人肝細(xì)胞（PHHs）是評(píng)估藥物作用和毒性的重要模型。然而，這種模型會(huì)迅速喪失肝細(xì)胞功能。其他肝細(xì)胞系也因功能不全和缺乏體內(nèi)研究微環(huán)境而受到限制。三維肝細(xì)胞模型為研究肝臟疾病、評(píng)估藥物代謝和藥代動(dòng)力學(xué)（PK）提供前景。目前已開(kāi)發(fā)出一系列用于肝功能研究的不同三維肝病模型，可用于急性和慢性藥物肝毒性預(yù)測(cè)、肝纖維化、脂肪肝、肝硬化和肝癌藥物篩選。三維模型能更準(zhǔn)確地揭示肝病的機(jī)理，使其成為更好的藥物篩選平臺(tái)。

圖4 用于篩選抗癌藥物（包括多柔比星(DOX)和順鉑(CIS)）的三維內(nèi)皮化肝腫瘤模型

2.2 胃腸（GI）道
消化道是指從胃到肛門(mén)的消化道，包括膽囊、小腸、大腸和直腸。是消化系統(tǒng)的主要通道，在食物消化、營(yíng)養(yǎng)吸收、免疫保護(hù)和激素合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。消化道疾病的高發(fā)病率仍然是影響公眾健康的一個(gè)重要問(wèn)題。針對(duì)這一健康問(wèn)題的研究日益增多，臨床前藥物測(cè)試依賴于體外模型得出的數(shù)據(jù)。最近關(guān)于三維方法的研究得到進(jìn)一步應(yīng)用。用于評(píng)估藥物和個(gè)性化治療疾病建模的三維消化道模型正在逐步建立。

圖5 消化道三維藥物篩選模型

2.3 腎臟
腎臟是藥物毒性作用的主要器官之一，腎臟損傷的早期階段很難被發(fā)現(xiàn)�；颊咄ǔＴ谀I臟嚴(yán)重受損甚至腎功能衰竭時(shí)才會(huì)知道。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在新藥研發(fā)階段參與臨床試驗(yàn)的候選者中，有30%的人因意料之外的腎毒性和不良反應(yīng)而退出臨床試驗(yàn)過(guò)程。因此，一個(gè)可靠的腎毒性預(yù)測(cè)模型可以保證臨床用藥的安全性，大大降低藥物開(kāi)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。近端腎小管是腎臟的敏感區(qū)域，藥物的代謝排泄過(guò)程通常發(fā)生在腎小管上皮細(xì)胞上。因此，腎毒性的早期預(yù)測(cè)在很大程度上依賴于近端腎小管。

圖6 模擬腎小球的三維球體模型，有助于快速篩選藥物

2.4 心臟

藥物誘發(fā)的心臟毒性可導(dǎo)致嚴(yán)重的心血管疾病，如心肌壞死、心肌梗死和嚴(yán)重的致命性心律失常，從而導(dǎo)致藥物開(kāi)發(fā)終止或退出市場(chǎng)�？菇M胺藥物特非那定（Terfenadine）就是這類(lèi)藥物的一個(gè)例子，它會(huì)阻塞心臟鉀通道，導(dǎo)致動(dòng)作電位延長(zhǎng)，使心電圖（ECG）上觀察到的QT間期顯著延長(zhǎng)。最終導(dǎo)致嚴(yán)重的心律失常，并可能導(dǎo)致死亡。抗生素、鎮(zhèn)靜劑和抗抑郁藥等藥物也具有類(lèi)似作用。心臟毒性通常在細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行評(píng)估，無(wú)法提供人體組織的真實(shí)情況。另一方面，動(dòng)物模型與人體缺乏轉(zhuǎn)化相關(guān)性，因此采用三維人體心臟模型是一種可取的方法。

圖7 利用從正常人體內(nèi)獲得的心臟成纖維細(xì)胞和iPSC-CM生成組織的示意圖

2.5 骨骼和軟骨
大量研究表明，三維模型中的細(xì)胞與二維模型中的細(xì)胞形態(tài)不同。細(xì)胞形態(tài)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、成熟、細(xì)胞程序性死亡以及遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)的合成等都有顯著影響。與二維培養(yǎng)的成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞相比，三維培養(yǎng)的細(xì)胞增殖率較低。此外，多項(xiàng)研究表明，三維模型具有增強(qiáng)成骨或軟骨作用的能力，三維細(xì)胞通常具有與體內(nèi)組織基本相似的基因表達(dá)譜。研究還發(fā)現(xiàn)，不同骨和軟骨模型具有不同的藥物敏感性。細(xì)胞在三維模型中通常比二維模型表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗藥性，二維模型可能是體內(nèi)藥物反應(yīng)的更好載體。

圖8 利用基于支架的方法生產(chǎn)PLMA水凝膠并創(chuàng)建體外OS模型

2.6 腦
全球約有六分之一的人受到神經(jīng)系統(tǒng)疾病的影響，這些疾病包括精神分裂癥、癲癇、老年癡呆癥、腦腫瘤等。目前，研究人員主要依賴于傳統(tǒng)的動(dòng)物模型，但動(dòng)物模型存在一些局限性，如成本高、耗時(shí)長(zhǎng)，而且動(dòng)物治療往往在臨床試驗(yàn)中失敗，因此，為了解神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病因和進(jìn)展促使研究人員尋求替代模型，以更好揭示神經(jīng)系統(tǒng)疾病并發(fā)現(xiàn)潛在的治療方法或藥物。為模擬三維神經(jīng)組織的復(fù)雜性，神經(jīng)類(lèi)器官是藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域的主要模型。

圖9 人類(lèi)脊髓類(lèi)器官組織（hSCOs）的生成過(guò)程

三、建立與生理相關(guān)微環(huán)境的要求

組織結(jié)構(gòu)和機(jī)械特性在調(diào)節(jié)各種生物活動(dòng)方面起至關(guān)重要的作用，包括干細(xì)胞分化、癌癥進(jìn)展和對(duì)抗癌治療的反應(yīng)。微環(huán)境（包括ECM成分、硬度等）控制細(xì)胞行為，并決定細(xì)胞對(duì)周?chē)鶨CM環(huán)境的反應(yīng)。要?jiǎng)?chuàng)建仿生三維模型進(jìn)行有效藥物篩選，細(xì)胞、生物材料、制造方式和刺激物的適當(dāng)組合至關(guān)重要。一般來(lái)說(shuō)，微環(huán)境可以通過(guò)組織物理、化學(xué)和生物特征反映出來(lái)。物理特征通常包括ECM排列、硬度和組織微結(jié)構(gòu)�；瘜W(xué)特征包括ECM成分和細(xì)胞因子，生物特征包括細(xì)胞組成和細(xì)胞間作用、自分泌和旁分泌、血管和神經(jīng)支配等。為設(shè)計(jì)出有效的體外藥物篩選裝置，在選擇細(xì)胞、生物材料、制造方式以及隨后的組織成熟過(guò)程時(shí)，都應(yīng)考慮這三個(gè)特征。



四、知識(shí)產(chǎn)權(quán)、行業(yè)和監(jiān)管環(huán)境
盡管三維模型已具有在藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域替代動(dòng)物模型的可行性，但在藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中，研究人員可能會(huì)對(duì)替代動(dòng)物模型表現(xiàn)出一定程度的猶豫，這需要研究人員、工業(yè)界和監(jiān)管部門(mén)的共同努力。在生物制造技術(shù)中，生物打印因其具有自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化處理的潛力而極具吸引力和前景。人造組織/器官類(lèi)別主要應(yīng)用于工業(yè)和研究領(lǐng)域，其中藥物測(cè)試、疾病模型研究和毒性評(píng)估是最多的應(yīng)用。然而，缺乏經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的科學(xué)驗(yàn)證和法規(guī)是應(yīng)用生物打印人體組織推動(dòng)藥物開(kāi)發(fā)的重要障礙。監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)新技術(shù)所需的科學(xué)驗(yàn)證可通過(guò)生物打印模型測(cè)試來(lái)實(shí)現(xiàn)。如果這些模型能夠可靠預(yù)測(cè)人體毒性，那么它們就會(huì)得到科學(xué)界的認(rèn)可，這自然會(huì)導(dǎo)致隨后的監(jiān)管調(diào)整。總之，研究人員應(yīng)積極尋求和收集來(lái)自各種實(shí)驗(yàn)的充足數(shù)據(jù)，以增強(qiáng)使用生物打印模型的信心。因此，隨著時(shí)間的推移，這些模型很可能會(huì)因支持證據(jù)的不斷增加而獲得監(jiān)管部門(mén)的認(rèn)可。不過(guò)，在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的初期階段，這些模型只能作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的補(bǔ)充。除進(jìn)一步工業(yè)化進(jìn)程外，樣品的一致性對(duì)標(biāo)準(zhǔn)藥物篩選方案和結(jié)果可靠性尤為重要。三維生物打印模型應(yīng)在結(jié)構(gòu)、功能和成熟度方面保持高度一致。總之，三維生物打印和醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)步需要克服目前的障礙。因此，為未來(lái)做好準(zhǔn)備對(duì)于從事知識(shí)進(jìn)步的研究人員、技術(shù)、行業(yè)以及支持和資助這些活動(dòng)的政府都至關(guān)重要。

五、總結(jié)與展望
三維組織模型在臨床前應(yīng)用方面的進(jìn)展和利用仍處于初級(jí)階段，而三維模型使用的日益增加為高效篩選藥物用于后續(xù)臨床前試驗(yàn)提供平臺(tái)，可提供更快的結(jié)果和更優(yōu)的成本效益。隨著創(chuàng)新技術(shù)的不斷進(jìn)步，三維模型也在努力創(chuàng)造出能夠大規(guī)模精確模擬體內(nèi)環(huán)境的模型。確保了其適用藥物篩選過(guò)程。從簡(jiǎn)單的球體到有機(jī)體，三維模型已經(jīng)發(fā)展到微流控芯片與生物打印相結(jié)合，在調(diào)整生物材料的動(dòng)態(tài)環(huán)境中構(gòu)建異細(xì)胞，以配合實(shí)時(shí)分析。個(gè)體化療法為最受歡迎的前瞻性應(yīng)用之一�？紤]到三維模型的復(fù)雜結(jié)構(gòu)及其模擬體內(nèi)環(huán)境的能力，規(guī)范藥物篩選實(shí)驗(yàn)方案并滿足量化標(biāo)準(zhǔn)變得至關(guān)重要。來(lái)自大量研究的充足數(shù)據(jù)應(yīng)得到科學(xué)驗(yàn)證。因此，監(jiān)管機(jī)構(gòu)和制藥公司可能會(huì)將三維模型作為加強(qiáng)和簡(jiǎn)化藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程的重要工具。

文章來(lái)源：
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2023.122408