生物3D打印人類皮膚，同時(shí)打印6種細(xì)胞極為罕見，“數(shù)量”也是一種創(chuàng)新

來(lái)源：上普生物

生物打印是一種有前途的替代方法來(lái)生產(chǎn)皮膚替代品，因?yàn)樗�可以�?fù)制皮膚的結(jié)構(gòu)組織進(jìn)入仿生層體外。在這項(xiàng)研究中，六種原代人類皮膚細(xì)胞類型被用來(lái)生物打印一個(gè)由表皮、真皮和皮下組成的三層皮膚構(gòu)建體。將生物打印的皮膚與人類細(xì)胞移植到 nu/nu 小鼠的全厚傷口上促進(jìn)了類似于天然人類表皮的表皮網(wǎng)狀脊的快速血管化和形成，具有正常外觀的細(xì)胞外基質(zhì)。細(xì)胞特異性染色證實(shí)了植入的細(xì)胞與再生皮膚的整合。

使用類似的方法，在豬切除傷口模型中，將5厘米乘5厘米生物打印的自體豬皮移植物移植到全層傷口上。生物打印皮膚移植改善皮膚脫皮，減少皮膚收縮，支持正常的膠原組織，減少纖維化。生物印跡自體皮片移植創(chuàng)面的差異基因表達(dá)顯示了促重塑蛋白酶活性。這些結(jié)果表明，生物打印皮膚可以支持皮膚再生，以允許非纖維化傷口愈合，并表明皮膚生物打印技術(shù)可能適用于人類臨床應(yīng)用。

擠壓生物打印用于用人類細(xì)胞[表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，黑素細(xì)胞，真皮成纖維細(xì)胞，F(xiàn)DPCs，真皮微血管 EC (DMECs)和脂肪細(xì)胞]制備多層仿生皮膚結(jié)構(gòu)(圖1A)。將細(xì)胞懸浮于三種基于纖維蛋白原的水凝膠生物墨水中(圖1B) ，并連續(xù)用層層生物墨水沉積印刷，以形成由人類皮膚，真皮和皮下組成的3cm × 3cm 三層仿生皮膚構(gòu)建體(圖1C)。細(xì)胞表現(xiàn)出正常的表型，經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)記證實(shí)(圖 S1)。在體外第7天(活細(xì)胞的77.7% ± 10.9) ，細(xì)胞活力在第13天和第21天維持在生物打印的皮膚中，細(xì)胞活力降低(分別為活細(xì)胞的58.2% ± 17.6和62.0% ± 36.9)(圖1，D 和 E)

生物打印和培養(yǎng)4天后，將生物打印的皮膚移植到小鼠的2.5 cm × 2.5 cm 全厚度傷口中，然后進(jìn)行90天(圖2A)。對(duì)照組包括僅使用水凝膠的生物打印對(duì)照組和未經(jīng)處理的傷口。數(shù)字圖像和平面測(cè)量用于監(jiān)測(cè)全傷口閉合，收縮和上皮化(圖1)。S2) ，有證據(jù)表明在前面描述的早期時(shí)間點(diǎn)上皮化改善(20)。到第14天，所有生物打印的皮膚處理的傷口完全閉合(分別為100.0.0% 和64.1 ± 5.0% ，64.8 ± 13.9% ; P < 0.0001)(圖2B)。所有三組均表現(xiàn)出收縮，在整個(gè)愈合過(guò)程中組間無(wú)顯著差異(分別為49.6 ± 20.3% ，53.8 ± 9.7% 和54.5 ± 12.4% ; P > 0.05) ，傷口閉合時(shí)間的差異是由于生物印刷皮膚處理的傷口早期上皮化(圖2C 和圖2)。中二)

早期新血管生成對(duì)愈合真皮的發(fā)育至關(guān)重要，并為長(zhǎng)期傷口愈合提供必要的營(yíng)養(yǎng)。人類皮膚(圖3A)和生物打印皮膚(圖3B)免疫熒光染色顯示具有人 CD31陽(yáng)性 EC 的內(nèi)層(綠色)和 CD146陽(yáng)性周細(xì)胞的外層(紅色)的血管腔，表明植入的人 EC 參與形成新生血管冠狀動(dòng)脈在再生皮膚和成熟通過(guò)招募宿主小鼠周細(xì)胞�；蛘撸�天然小鼠皮膚，水凝膠和僅傷口對(duì)照每個(gè)顯示只有少數(shù) CD146陽(yáng)性周細(xì)胞和沒(méi)有人類 CD31陽(yáng)性細(xì)胞(圖3C)。用 CD146(圖3D)和 H & E 染色(圖3E)對(duì)毛細(xì)血管進(jìn)行免疫檢測(cè)，以定量90天內(nèi)愈合傷口的血管狀況。與對(duì)照水凝膠和未處理的傷口相比，生物打印的皮膚處理的傷口顯示出顯著更大的血管密度(24.7 ± 3.8,17.8 ± 3.0,13.7 ± 3.4; P < 0.0001; 圖3F 和圖。S4) ，并且由比水凝膠和未處理的對(duì)照更小(< 500μm)和中等大小(500至1000μm)的毛細(xì)血管組成(圖3G)。在第42天也出現(xiàn)了類似的趨勢(shì)，到第90天，所有組的血管大小分布和密度都正常化了(圖1)。

臨床翻譯的下一步是將該技術(shù)推廣到一個(gè)明確的臨床前豬創(chuàng)傷模型(圖5A)。從皮膚和頸動(dòng)脈活組織檢查(圖5，B 和 C)分離自體球菌素角質(zhì)形成細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，EC 和前脂肪細(xì)胞，并在體外擴(kuò)增28天。同種異體皮膚細(xì)胞平行培養(yǎng)。雖然成功地從活檢組織中獲得細(xì)胞并擴(kuò)增，但所有細(xì)胞類型的成功分離和培養(yǎng)在跨治療組和動(dòng)物中并不一致(表 S2)。

H & E (圖6A)和 Masson 三色(圖6B)染色顯示，與生物打印的移植物和僅水凝膠對(duì)照相比，生物打印的自體移植物中表皮厚度和原始脊的存在增加。Picrosirius 紅色染色顯示，生物打印的自體移植物具有與未受損豬皮相似的紅/黃/綠纖維染色比率，并且具有相似的籃狀編織細(xì)胞外間質(zhì)(ECM)組織，與生物打印的同種異體移植物和僅水凝膠處理的傷口中的平行的纖維化組織相比，強(qiáng)烈的紅/黃染色的 ECM (圖6C)(13)。免疫熒光染色顯示在生物打印的自體移植物中表皮成熟改善，具有幾個(gè)強(qiáng)大的 KRT14 + 基底角質(zhì)形成細(xì)胞和愈傷組織蛋白(IVL) + 淺表角質(zhì)形成細(xì)胞層(圖6D，頂行)。IVL 和波形蛋白染色的進(jìn)一步研究顯示，與生物打印的自體移植相比，對(duì)照組的纖維母細(xì)胞性增加(圖6D，底部行)。

這項(xiàng)研究的發(fā)現(xiàn)受到使用小型和大型動(dòng)物模型的限制，這些動(dòng)物模型可能不能完全概括人類傷口愈合。對(duì)于松弛的皮膚 nu/numouse 模型尤其如此，在這種模型中，傷口更有可能通過(guò)收縮而不是上皮化來(lái)關(guān)閉。這項(xiàng)工作也是有限的技術(shù)轉(zhuǎn)化為人類使用。阻礙翻譯的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)是細(xì)胞分離和擴(kuò)增的挑戰(zhàn)。本研究中自體豬生物打印皮膚的生產(chǎn)允許創(chuàng)建自體纖維化和擴(kuò)張的標(biāo)準(zhǔn)操作程序，生成生理細(xì)胞密度(大于10 × 106個(gè)細(xì)胞/ml 生物墨水)的打印皮膚所需的數(shù)百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。通過(guò)產(chǎn)生大約5 × 106個(gè)細(xì)胞/平方厘米的皮膚活檢，我們能夠在28天內(nèi)產(chǎn)生全厚皮膚從9到25平方厘米增加的表面積，沒(méi)有嚙合。

在臨床上，這一步驟可以通過(guò)在病人初次出現(xiàn)時(shí)進(jìn)行小型穿刺活組織檢查來(lái)完成，以便有足夠的時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增。細(xì)胞分離和擴(kuò)增的過(guò)程將需要用自動(dòng)化組織過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，以充分實(shí)現(xiàn)這種技術(shù)的潛力，包括增加細(xì)胞產(chǎn)量，自動(dòng)化細(xì)胞培養(yǎng)減少污染，以及評(píng)估移植和傷口再生功效的最低必要細(xì)胞。

總之，具有多種細(xì)胞類型的生物打印人皮膚構(gòu)建體能夠促進(jìn)和加速小鼠全層創(chuàng)面的愈合。生物印跡豬自體移植物通過(guò)再上皮化和減少收縮改善了豬全層傷口的愈合。這種愈合過(guò)程導(dǎo)致了非纖維化膠原重塑。這些發(fā)現(xiàn)表明，細(xì)胞增殖的移植物支持傷口愈合，自體細(xì)胞進(jìn)一步支持非纖維化表皮和真皮再生。總之，我們的研究結(jié)果表明，生物打印自體皮膚迅速整合到傷口中，以支持皮膚再生，并提出了皮膚生物打印技術(shù)治療全厚度傷口的可能性。

原文：https://www.science.org/doi/10.1126/scitranslmed.adf7547