3D打印組織模型：從水凝膠到生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

來源： GK綠鑰生物科技

米蘭比可卡大學(xué)生物技術(shù)與生物科學(xué)系Laura Russo教授團隊在《Journal of Controlled Release》期刊發(fā)表綜述“3D printed tissue models: From hydrogels to biomedical applications”文章簡要介紹了細胞外基質(zhì)（ECM）的形態(tài)和生化特性對于開發(fā)類似于人體器官和組織結(jié)構(gòu)和功能特性的新型先進結(jié)構(gòu)的重要性。作者描述了ECM在不同組織、器官、健康和病理狀態(tài)下的形態(tài)和生化特性如何變化，以及如何通過生物打印生成具有所需特性的ECM模擬物。作者介紹了3D打印過程中生物墨水水凝膠的天然和合成的聚合物材料，特別介紹了它們的功能化與對生物信號分子交聯(lián)和共軛的效果，以指導(dǎo)開發(fā)生物響應(yīng)和生物指導(dǎo)ECM模擬物。

生物3D打印的出現(xiàn)為組織工程和體外先進組織模型開辟了新的機會。生產(chǎn)先進3D組織模型的難點在于合成適合的生物墨水。同時生物墨水能夠提供誘導(dǎo)不同細胞產(chǎn)生新基質(zhì)的信號，理想地再現(xiàn)特定體內(nèi)細胞環(huán)境。事實上，用于開發(fā)油墨和生物墨水的傳統(tǒng)方法主要集中在控制水凝膠的物理性質(zhì)上，而忽略了水凝膠材料對生化信號的影響。

在腫瘤微環(huán)境（TME）中， ECM的機械特性和結(jié)構(gòu)與腫瘤惡性腫瘤和轉(zhuǎn)移潛力密切相關(guān)。在組織纖維化中ECM成分的異常沉積是主要驅(qū)動因素之一。ECM的剛度對機械誘導(dǎo)途徑的影響已經(jīng)有大量的研究。一些研究強調(diào)了物理性質(zhì)在驅(qū)動細胞粘附、組織、代謝和信號傳導(dǎo)方面的重要性。機械誘導(dǎo)過程是研究最多的ECM-細胞相互作用機制之一，受細胞表面整合素調(diào)控。它是一種動態(tài)機制，通過對沉積速率和特性的精細控制來調(diào)節(jié)新合成的ECM組分。ECM在維持組織穩(wěn)態(tài)或誘導(dǎo)病理狀況方面也通過其他機制（如細胞受體相互作用）控制。蛋白聚糖、酶、生長因子和多種生物大分子誘導(dǎo)信號級聯(lián)反應(yīng)，其調(diào)節(jié)作用如表1所示。

表1 具有調(diào)節(jié)作用的主要生物分子

ECM重塑是一種動態(tài)機制，它允許不同的細胞群在更合適的微環(huán)境中存活并發(fā)揮其功能。細胞群包括干細胞和分化細胞、免疫系統(tǒng)細胞。當(dāng)這些成分的生理相互作用或重塑變得異常時，就會發(fā)生慢性或急性病理現(xiàn)象。ECM特性不僅僅是特定組織階段的結(jié)果，而且在組織形態(tài)發(fā)生的進展和功能的維持中起著關(guān)鍵作用。
表2報告了與不同病理相關(guān)的ECM特征示例。生成人造組織的生物3D打印結(jié)構(gòu)的設(shè)計必須從ECM在不同器官、生理和病理狀態(tài)下的特性中找到規(guī)律。

表2 病理條件下ECM調(diào)節(jié)的例子

作者認為用于開發(fā) 3D 生物打印模型的細胞友好型聚合物的選擇取決于它們與不同細胞群的相容性。隨著3D打印工藝和儀器的進步，大量基于天然和合成聚合物的生物墨水也被重新分類、定義和標(biāo)準(zhǔn)化。聚合物的分類主要包括天然聚合物和合成聚合物。

圖2 用于配制油墨和生物油墨的天然（多糖和蛋白質(zhì)）和合成聚合物的選定實例

天然聚合物和合成聚合物具有不同的特性、優(yōu)點和局限性。天然聚合物的優(yōu)勢在于其天然的生物相容性，而合成聚合物缺乏細胞命運調(diào)節(jié)所需的生物分子基序，但提供了對機械和結(jié)構(gòu)特性的改進控制。研究人員將天然和合成聚合物結(jié)合開發(fā)了多種用于生物打印的混合型生物墨水，可適用于打印生成具有可定制形態(tài)和細胞特異性的三維ECM模擬物。

在生物打印方法中，細胞群或類器官在打印過程之前、期間或之后包埋在水凝膠或水凝膠前體中。在生物打印過程中必須保證細胞活力，另一方面，墨水中殘留細胞的存在會影響生物墨水的打印性，并最終影響構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)保真度。

圖3 生物墨水與普通打印墨水

作者介紹了生物可打印聚合物的物理和化學(xué)交聯(lián)。生物3D打印結(jié)構(gòu)是使用能夠產(chǎn)生物理交聯(lián)的生物墨水生成的，定義為“物理水凝膠”。物理水凝膠是由通過不同相互作用相互連接的聚合物獲得的，包括離子和疏水相互作用或熱轉(zhuǎn)變，最近，人們探索了自組裝肽作為生物相容性生物墨水，可以輕松通過控制pH值或添加二價離子形成物理交聯(lián)。即使物理水凝膠在易于制備構(gòu)建體方面具有明顯的優(yōu)勢，但可采用的聚合物數(shù)量有限以及難以準(zhǔn)確控制機械和生化性能會損害應(yīng)用方向。最近的工作主要集中在混合或多組分生物材料的開發(fā)上，其中物理和化學(xué)交聯(lián)策略相結(jié)合，利用可逆共價鍵產(chǎn)生動態(tài)水凝膠（圖4）。

圖4 A：測試的打印條件和相圖，以在打印性能、擠出性和均勻性方面實現(xiàn)最佳油墨開發(fā)。B：具有網(wǎng)格狀3D多孔結(jié)構(gòu)的支架示例

細胞相容性和偶聯(lián)方法的驗證是開發(fā)高級可定制生物墨水的重要方法。表3收集了物理交聯(lián)和共價交聯(lián)方法的實例，包括動態(tài)交聯(lián)和可逆交聯(lián)方法。

表3 部分用于油墨和水凝膠的靜態(tài)和動態(tài)交聯(lián)的共軛方法

作者隨后就對水凝膠特性的控制做了描述。ECM在細胞命運中的指導(dǎo)性作用不僅取決于材料的物理性質(zhì)，還取決于其化學(xué)成分以及提供特定相互作用和信號級聯(lián)的不同生物分子的存在。因此，功能性ECM模擬物的開發(fā)必須包括此類生物活性因子，其含量、濃度和梯度將改變構(gòu)建體的功能。聚合物分子的片段，特別是肽序列（如RGD）以及效應(yīng)蛋白（如生長因子或酶）。它們的作用是多方面的，包括正確的細胞基質(zhì)粘附，對細胞存活至關(guān)重要，與細胞受體（整合素、選擇素等）相互作用以啟動信號級聯(lián)，甚至是誘導(dǎo)功能變化的酶促過程。

隨后，作者描述了將天然ECM生成功能化ECM模擬物最具創(chuàng)新性的方法是將天然ECM或?qū)⑵涮囟ǖ鞍灼�段加入可打印的生物墨水聚合物中�?br />

圖5 A：豬（p）和牛（b）來源的脫細胞組織用H&E染色。去除細胞物質(zhì)后殘留的脫細胞細胞外基質(zhì)呈粉紅色。B：在銑削前掃描每種脫細胞組織類型的電子圖像，突出顯示獨特的多孔和纖維結(jié)構(gòu)。C：銑削產(chǎn)生的用于生活用紙制造的dECM粉末的掃描電子圖像。

表4 ECM 模擬使用dECM生成的

將dECM 與其他聚合物結(jié)合使用的最有前途的方法學(xué)方法（表5）。De Santis等人報道了基于dECM增強的藻酸鹽的可打印生物基質(zhì)的合成; Pati等人利用分別從豬軟骨和心臟獲得的dECM來生產(chǎn)不同3D結(jié)構(gòu)的生物墨水。如圖6所示，作者分別使用心臟dECM（hdECM）、軟骨dECM（cdECM）和脂肪dECM（adECM）與聚己內(nèi)酯（PCL）相結(jié)合，制作了心臟構(gòu)建體、軟骨構(gòu)建體和脂肪構(gòu)建體。所有獲得的構(gòu)建體都允許產(chǎn)生具有增加均勻細胞分布的組織類似物，并具有脂肪生成和軟骨生成潛力。Kim等人提出了用明膠強化豬肝dECM的方法，該團隊將開發(fā)的dECM粉末基生物墨水（dECM pBio-ink）與明膠和dECM基墨水（圖6 ii）進行了比較，結(jié)果相比dECM更具有可觀的機械性能以及與內(nèi)皮細胞和原代肝細胞的生物相容性。對dECM組分進行了功能化能更好地控制dECM增強油墨的降解速率和力學(xué)性能。

圖6  i：由dECM和PCL制成的載細胞結(jié)構(gòu)用作生物墨水；ii：顯微鏡圖像 （比例尺：200 μm）和測量的形狀保真度具有不同孔徑的2% dECM pBio-ink的打印晶格圖案。3種生物油墨的肝形結(jié)構(gòu)打印效果；iii：開發(fā)腎小球前模型。

圖7 i:纖維蛋白腦模擬生物墨水與3D工程打印可灌注血管網(wǎng)絡(luò)集成; ii:3D生物打印許可復(fù)制基于光交聯(lián)肝臟dECM的水凝膠

作者繼續(xù)描述了關(guān)于生物3D打印模型的應(yīng)用相關(guān)內(nèi)容。3D打印技術(shù)的進步以及對病理和健康狀態(tài)下ECM特征的了解的增加，使得生物打印結(jié)構(gòu)能夠更好地模擬組織的形態(tài)、生化和功能特征。在體外建模中，重現(xiàn)人體細胞的3D組織模型，控制其物理和生物分子特性，并確定相關(guān)細胞命運的能力，將極大地有助于我們了解幾種疾病發(fā)病機制中的關(guān)鍵參與者。生物3D打印在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用是一個有吸引力和挑戰(zhàn)性的話題。生物3D打印在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用主要集中在骨軟骨和心血管疾病上（表6）。

表5 通過生物打印獲得的組織和體外模型的例子

即使組織可擴展性和功能性仍然是一個開放的挑戰(zhàn)，建立具有可定制形態(tài)的多細胞結(jié)構(gòu)的能力對于功能性組織和器官替代品的生成是有利的。該領(lǐng)域的新趨勢包括直接在體內(nèi)進行的生物3D打印，手術(shù)中生物打�。↖OB）或原位生物打印對軟骨、皮膚和骨骼在內(nèi)的不同組織具有明顯的成效。Albanna等人將生物3D打印系統(tǒng)應(yīng)用于小鼠和豬模型中的自體或同種異體真皮移植。在這里，研究人員將真皮成纖維細胞加入至牛纖維蛋白和I型膠原水凝膠中，并在真皮層受傷的部位中進行逐層生物打印，促進皮膚再生。即使作者觀察到早期形成的真皮層和成熟的真皮層之間存在差異，但所提出的方法也為具有高轉(zhuǎn)化潛力的新治療機會開辟了道路（圖8）。

圖8：皮膚生物打印機原型和原位生物打印概念：i：演示皮膚生物打印機規(guī)模的示意圖; ii：系統(tǒng)的主要組成部分;iii：皮膚生物打印概念; iv和v皮膚生物打印過程的例子

總結(jié)：3D打印和生物打印工藝正在成為適用于不同生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的強大技術(shù)。在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，這些技術(shù)允許開發(fā)更準(zhǔn)確和功能更強大的3D組織模型，甚至是可用于先進的生物測定和個性化藥物測試的器官模擬。該文章中的許多應(yīng)用和未來富有想象力的應(yīng)用，包括功能器官的復(fù)制。挑戰(zhàn)在于能夠合理化細胞命運與ECM結(jié)構(gòu)的許多變量之間的相關(guān)性，以及在3D模型中準(zhǔn)確再現(xiàn)各種結(jié)構(gòu)和生物分子特征的能力。

文章來源：https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2023.01.048