3D打印仿真半月板支架結(jié)合自體滑膜移植有望克服半月板再生問題

來源：EngineeringForLife

半月板是膝關(guān)節(jié)內(nèi)復(fù)雜而重要的纖維軟骨組織。目前半月板再生仍是一項(xiàng)較為困難的問題。近日，來自北京大學(xué)的敖英芳、程錦、胡曉青教授團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了受半月板成熟和再生過程啟發(fā)的半月板再生技術(shù)的相關(guān)研究。研究成果以“Meniscal fibrocartilage regeneration inspired by meniscal maturational and regenerative process”為題于11月08日發(fā)表在《Science Advances》上。

本文利用轉(zhuǎn)基因小鼠模型明確間充質(zhì)干細(xì)胞參與半月板的成熟和再生過程。同時(shí)受半月板成熟和再生過程啟發(fā)，研究人員開發(fā)了一種有效的轉(zhuǎn)化策略，通過3D打印生物仿真半月板支架，結(jié)合自體滑膜移植，促進(jìn)半月板再生。在大型動(dòng)物模型中本文驗(yàn)證了該方法可以促進(jìn)各向異性半月板樣組織再生，并保護(hù)軟骨免于退化。從機(jī)制上講，生物支架的力學(xué)特性和基質(zhì)硬度上調(diào)Piezo1的表達(dá)，促進(jìn)鈣調(diào)素和NFATc1協(xié)同激活，進(jìn)一步激活YAP-pSmad2/3-SOX9軸，從而誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞形成纖維軟骨，進(jìn)一步促進(jìn)半月板再生。此外，力學(xué)特性和基質(zhì)硬度激活的Piezo1可進(jìn)一步上調(diào)膠原交聯(lián)酶的表達(dá)，從而催化膠原交聯(lián)，進(jìn)而增強(qiáng)再生組織的機(jī)械性能。

本文從以下幾個(gè)方面進(jìn)行詳細(xì)描述

1. 間充質(zhì)干細(xì)胞參與轉(zhuǎn)基因小鼠半月板成熟和再生過程

2. 3D打印PCL支架結(jié)合自體滑膜移植策略在大型動(dòng)物模型中促進(jìn)半月板再生并保護(hù)軟骨免于退化

3. 生物力學(xué)刺激通過YAP-pSmad2/3-SOX9軸誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞形成纖維軟骨

4. Piezo1通過協(xié)同激活鈣調(diào)素和NFAT介導(dǎo)機(jī)械傳導(dǎo)

5. 基質(zhì)硬度對(duì)YAP-pSmad2/3-SOX9軸的影響分析

6. 半月板再生過程中膠原交聯(lián)重塑分析

圖1 通過轉(zhuǎn)基因小鼠明確間充質(zhì)干細(xì)胞在半月板成熟和再生中的作用

為確定間充質(zhì)干細(xì)胞在半月板成熟過程中的作用，本文使用轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行鑒定。血小板衍生生長(zhǎng)因子α（Pdgfrα）陽性間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)tdtomato蛋白（紅色熒光蛋白（RFP））。小鼠出生后8周開始使用他莫昔芬誘導(dǎo)1周，10周取出小鼠膝關(guān)節(jié)。免疫熒光染色顯示，半月板中存在RFP/SOX9/Collagen I (COL I)/COL II陽性細(xì)胞。表明間充質(zhì)干細(xì)胞在出生后8至10周時(shí)間內(nèi)分化為半月板纖維軟骨細(xì)胞。出生后10周間充質(zhì)干細(xì)胞在仍存在半月板中。因此，間充質(zhì)干細(xì)胞參與小鼠半月板的成熟過程。之前研究表明，小鼠等小動(dòng)物模型具有相對(duì)較強(qiáng)的體內(nèi)愈合能力。小動(dòng)物可能是研究半月板再生過程的合適模型。為研究間充質(zhì)干細(xì)胞在半月板再生中的作用，在對(duì)Pdgfrα-CreER; Rosa26-LSL-Tdtomato轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)后，接著對(duì)內(nèi)側(cè)半月板行半月板全切或次全切。術(shù)后3月，通過組織染色發(fā)現(xiàn)大量富含糖胺聚糖（GAG）、COL I和COL II的再生半月板纖維軟骨樣組織。此外，再生組織中還出現(xiàn)RFP/COL I/COL II/SOX9陽性細(xì)胞。表明間充質(zhì)干細(xì)胞參與半月板的再生過程，分化為半月板纖維軟骨細(xì)胞�？傊�，以上結(jié)果表明間充質(zhì)干細(xì)胞參與小鼠半月板的成熟和再生過程。

圖2 3D打印半月板支架結(jié)合自體滑膜移植促進(jìn)半月板再生，在豬半月板次全切模型中保護(hù)軟骨免于退化

為驗(yàn)證自體滑膜移植對(duì)半月板再生的影響，本文使用小鼠半月板次全切（90%切除）模型。首先，對(duì)內(nèi)側(cè)半月板進(jìn)行次全切。接著按解剖結(jié)構(gòu)植入3D打印的聚ε-己內(nèi)酯（PCL）半月板支架，并用縫線固定殘余半月板組織，從髕上滑囊取自體滑膜組織，并將其鋪在表面（圖2A3）。最后對(duì)關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)進(jìn)行復(fù)位。為追蹤半月板再生和軟骨狀況，術(shù)后兩個(gè)月進(jìn)行微創(chuàng)關(guān)節(jié)鏡檢查。經(jīng)過綜合評(píng)估，關(guān)節(jié)腔內(nèi)未發(fā)現(xiàn)松動(dòng)假體，半月板支架完整而牢固的固定在其中。整個(gè)半月板支架都被新形成血管豐富的組織覆蓋。為進(jìn)一步評(píng)估新形成組織的含量和軟骨情況，術(shù)后2個(gè)月研究人員進(jìn)行取材，結(jié)果發(fā)現(xiàn)再生組織在形態(tài)和顏色上與原生半月板相似，且對(duì)脛骨軟骨覆蓋、外周囊連接以及脛骨平臺(tái)的前后附著保持良好（圖2，C1至C3）。脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)和股骨內(nèi)側(cè)髁（MFC）只有輕微軟骨磨損。髕股關(guān)節(jié)未發(fā)現(xiàn)軟骨退化情況。內(nèi)側(cè)副韌帶附著點(diǎn)骨塊愈合良好。術(shù)后4個(gè)月，再生組織與原生半月板相似度進(jìn)一步提高。脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)存在適度軟骨磨損。在MFC中僅觀察到輕度軟骨磨損。髕股關(guān)節(jié)軟骨狀況仍保持正常。在假手術(shù)組中，所有關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)均保持正常，表明手術(shù)未造成不良影響。次全切組僅有部分軟組織附著在殘余半月板上，軟骨退化明顯。在空白PCL支架組，支架上可觀察到一些不規(guī)則軟組織存在，軟骨發(fā)生侵蝕和缺損，內(nèi)側(cè)結(jié)外韌帶上端附著部位的骨塊愈合良好。

圖3 3D打印半月板支架結(jié)合自體滑膜移植促進(jìn)各向異性半月板再生

半月板由前至后分為三部分，包括前角、體部和后角。研究人員對(duì)每個(gè)部分的內(nèi)區(qū)、中區(qū)和外區(qū)進(jìn)行分析（圖3A2）。在半月板次全切組中，只觀察到一些疏松的纖維組織和纖維血管，GAGs較少。細(xì)胞主要由紡錘形的成纖維細(xì)胞組成�？瞻譖CL支架組中，支架內(nèi)可觀察到一些纖維組織、纖維血管和較少的纖維軟骨組織。新形成的組織與周圍半月板結(jié)合較差。細(xì)胞成分中含有一些紡錘形的成纖維細(xì)胞和較少的橢圓形至圓形的軟骨細(xì)胞。再生組織中可見血管。術(shù)后4個(gè)月時(shí)仍有PCL殘留。PCL支架+滑膜移植組形成的纖維、纖維血管較少，而纖維軟骨基質(zhì)較多，具有不同數(shù)量的膠原和富含GAG的基質(zhì)。再生組織由紡錘形的纖維母細(xì)胞樣細(xì)胞和更多橢圓形至圓形的軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞組成，再生組織中觀察到了血管。接下來，對(duì)再生組織中COL I和COL II的沉積情況進(jìn)行分析，在PCL支架+滑膜移植組中，再生組織中含有豐富的COL I和COL II。COL II基質(zhì)主要分布在再生組織的內(nèi)區(qū)和中區(qū)，與原生半月板相似，表明COL II呈各向異性分布。整個(gè)組織富含COL I，但主要分布在中外層，與原生半月板相似，表明 COL I呈各向異性分布。用雙光子顯微鏡評(píng)估再生組織中膠原蛋白的含量。與半月板次全切組和空白PCL支架組相比，PCL支架+滑膜移植組再生組織的膠原蛋白含量更高，更接近于原生半月板的膠原蛋白含量。對(duì)原生半月板和再生組織的降低模量進(jìn)行評(píng)估顯示，半月板次全切組和空白PCL支架組的再生組織過于柔軟，無法測(cè)量。PCL支架+滑膜移植組接近原生半月板的降低模量（35.25 ± 4.19 MPa）。此外，再生組織和原生半月板中均未出現(xiàn)COL10A1，表明半月板沒有肥厚。血管造影顯示，PCL支架+滑膜移植組的再生組織在術(shù)后2個(gè)月時(shí)血管豐富。術(shù)后4個(gè)月，血管含量明顯減少。PCL支架+滑膜移植組的軟骨磨損、蛋白多糖丟失較少，骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織病理評(píng)估系統(tǒng)（OARSI）評(píng)分較低，迷你豬在術(shù)后2個(gè)月和4個(gè)月內(nèi)恢復(fù)正常步態(tài)。

圖4 基質(zhì)硬度對(duì)YAP-pSmad2/3-SOX9軸的影響

與術(shù)后2個(gè)月相比，PCL支架+滑膜移植組再生組織在術(shù)后4個(gè)月的機(jī)械性能明顯增加。之前研究表明，基質(zhì)硬度是影響YAP激活的另一個(gè)關(guān)鍵因素。研究人員假設(shè)基質(zhì)硬度會(huì)影響YAP-pSmad2/3-SOX9軸。首先，為構(gòu)建不同基質(zhì)硬度條件，將人SMSCs接種到柔軟的硅膠培養(yǎng)板或傳統(tǒng)硬質(zhì)聚苯乙烯培養(yǎng)板上。在硬質(zhì)基質(zhì)條件下培養(yǎng)后，YAP-pSmad2/3-SOX9軸被激活，YAP、pSmad2/3和SOX9表達(dá)上調(diào)，pYAP表達(dá)下調(diào)。人SMSCs表現(xiàn)出纖維軟骨表型，COL I、COL II、凝集素和GAG表達(dá)上調(diào)。其次，先前研究表明Piezo1能感知基質(zhì)的硬度。硬基質(zhì)處理后，Piezo1的表達(dá)明顯上調(diào)，隨后下游鈣調(diào)蛋白、鈣調(diào)神經(jīng)蛋白和去磷酸化NFATc1的表達(dá)也上調(diào)。因此，Piezo1可通過協(xié)同激活鈣調(diào)蛋白和NFATc1來感知基質(zhì)硬的程度，繼而激活YAP-pSmad2/3-SOX9軸，促進(jìn)人SMSCs生成纖維軟骨。有綜述表明，硬基質(zhì)可通過整合素-FAK（局灶性粘附激酶）信號(hào)通路促進(jìn)YAP的核轉(zhuǎn)位和活化。本文研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)整合素-FAK信號(hào)通路被顯著激活，整合素α5（ITGA5）、FAK和磷酸化FAK（pFAK）表達(dá)上調(diào)。磷酸化LATS1則明顯下調(diào)，導(dǎo)致YAP磷酸化減少。因此，硬質(zhì)底物誘導(dǎo)的整合素-FAK信號(hào)激活抑制了Hippo信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)YAP的核轉(zhuǎn)位和激活。最后，對(duì)PCL支架+滑膜移植組和原生豬半月板再生組織中FAK信號(hào)激活情況進(jìn)行評(píng)估。再生細(xì)胞和原生豬半月板纖維軟骨細(xì)胞FAK和pFAK表達(dá)明顯升高。術(shù)后4個(gè)月時(shí)，再生細(xì)胞中FAK和pFAK的表達(dá)比術(shù)后2個(gè)月時(shí)有所增加。因此，以上結(jié)果表明，在半月板再生過程中，硬基質(zhì)通過激活Piezo1和FAK信號(hào)調(diào)控YAP-pSmad2/3-SOX9軸發(fā)揮作用。

圖5 生物力學(xué)和基質(zhì)硬度通過Piezo1調(diào)節(jié)膠原交聯(lián)酶（LOX和LH）的表達(dá)

膠原纖維交聯(lián)程度是決定半月板機(jī)械性能的關(guān)鍵因素，賴氨酰氧化酶（LOX）和賴氨酰羥化酶（LH）是使膠原交聯(lián)的主要酶。先前研究表明，Piezo1導(dǎo)致原生肌腱組織中膠原交聯(lián)酶-LOX的上調(diào)。在此，研究人員假設(shè)Piezo1是半月板再生過程中膠原交聯(lián)酶的上游。如前所述，在CTS或硬基質(zhì)處理后，Piezo1在人SMSCs中上調(diào)。本文結(jié)果顯示人SMSCs經(jīng)CTS處理后，LOX和LH2（LH家族成員之一）的表達(dá)顯著上調(diào)。LOX、LH1、LH2和LH3的mRNA均上調(diào)。此外，Piezo1激動(dòng)劑-YODA1處理后，人SMSCs中LOX和LH的表達(dá)上調(diào)，而Piezo1拮抗劑-GsMTx-4處理后，LOX和LH的表達(dá)下調(diào)。因此，硬基質(zhì)可上調(diào)人SMSCs中LOX和LH的表達(dá)。接著本文對(duì)PCL支架+滑膜移植組和原生豬半月板再生組織中LOX和LH2的表達(dá)進(jìn)行了評(píng)估。再生組織和原生豬半月板LOX和LH2表達(dá)均明顯升高。因此，生物力學(xué)特性和硬基質(zhì)誘導(dǎo)Piezo1上調(diào)促進(jìn)LOX和LH的表達(dá)，從而在半月板再生過程中催化膠原交聯(lián)。

總結(jié)與展望
總之，本文利用轉(zhuǎn)基因小鼠模型明確了間充質(zhì)干細(xì)胞參與半月板的成熟和再生過程。在大型動(dòng)物模型中，3D打印PCL支架結(jié)合自體滑膜移植促進(jìn)各向異性半月板樣組織再生，并保護(hù)軟骨免于退化。從機(jī)制上講，生物力學(xué)和基質(zhì)硬度上調(diào)間充質(zhì)干細(xì)胞中Piezo1的表達(dá)，促進(jìn)鈣離子內(nèi)流和鈣調(diào)素及NFATc1的協(xié)同激活，并進(jìn)一步激活半月板再生過程中的YAP-pSmad2/3-SOX9軸。此外，Piezo1可上調(diào)間充質(zhì)干細(xì)胞中LOX和LH的表達(dá)，從而催化膠原交聯(lián)，增強(qiáng)再生組織的力學(xué)性能。因此，結(jié)合自體滑膜移植的3D打印生物仿真半月板支架將是一種有效的轉(zhuǎn)化策略，可用于促進(jìn)半月板再生。值得在臨床上進(jìn)一步研究。

文章來源：
https://www.science.org/doi/full ... Arid%3Acrossref.org