基于人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源心肌細(xì)胞的功能性心肌組織直接3D打印構(gòu)建

來源： 生物打印與再生工程

生物制造的一個目標(biāo)是通過設(shè)計組織、器官或它們的一部分來研究或治療治療方法有限的疾病，如終末期器官衰竭。但是當(dāng)前傳統(tǒng)生物制造方法具有細(xì)胞難定殖，不能生成有層次的結(jié)構(gòu)等局限性。鑒于目前生物制造的局限性，特別是在心臟組織工程領(lǐng)域，需要開發(fā)一種方法，利用生物3D打印將人體誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞（hiPSC-CMs）直接打印到功能性心臟組織中。然而，直接打印活細(xì)胞已被證明是困難的。

來自德國埃爾朗根大學(xué)的T.U. Esser團(tuán)隊于2023年9月在ADVANCED MATERIALS發(fā)表了一篇名為《Direct 3D-Bioprinting of hiPSC-derived Cardiomyocytes to Generate Functional Cardiac Tissues》的文章，文中提出了一種直接3D生物打印人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSC)來源的心肌細(xì)胞的方法——在膠原透明質(zhì)酸墨水中，以準(zhǔn)確和可重復(fù)的方式打印厘米大小的功能性環(huán)形和心室形狀的心臟組織。打印的組織含有hiPSC衍生的心肌細(xì)胞，具有組織良好的肌體，并表現(xiàn)出自發(fā)和規(guī)律的，持久的收縮，而且能夠抵抗被動受力。打印心臟組織的跳動頻率可以通過藥物刺激來調(diào)節(jié)。這種方法為產(chǎn)生復(fù)雜的功能心臟組織提供了新的可能性：可以用于制造高級藥物篩選的模型，也可以用于器官修復(fù)或替換的組織移植。

實驗結(jié)果與討論

一、懸浮支撐浴的制備
凝膠內(nèi)懸浮打印需要一個支撐浴。支撐浴一方面提供足夠的穩(wěn)定性來保持打印液體墨水的形狀，另一方面能夠使打印噴嘴通過。為了將hiPSC衍生的心肌細(xì)胞(hiPSC-CMs)打印成復(fù)雜的形狀，該團(tuán)隊開發(fā)了一種簡單的三步雙組分方案，通過復(fù)雜凝聚生產(chǎn)明膠/阿拉伯膠微粒。微顆粒以圓形為主，(直徑69±27 μm，圖1b,c)。通過離心壓實后，微粒形成了具有自愈特性的支撐浴，允許打印噴嘴自由通過。即使容器被倒置，打印到支撐浴中的食用染料也能保持在原位(圖1d)。

在測試頻率范圍內(nèi)，支撐浴顯示出固體狀行為以及剪切稀化行為(圖1f)。此外，在交替剪切速率下，支撐浴表現(xiàn)出近乎瞬時和完全的恢復(fù)行為(圖1g)。

圖1 壓實后的微顆粒表現(xiàn)出剪切變薄和自愈的特性

二、膠原蛋白/透明質(zhì)酸生物墨水能夠精確和重現(xiàn)復(fù)雜結(jié)構(gòu)的打印

為了評估膠原蛋白在上述支撐浴中的可打印性，該團(tuán)隊用不同濃度的膠原墨水打印脫細(xì)胞環(huán)狀結(jié)構(gòu)(圖2a)。此外，透明質(zhì)酸(HA)（一種糖胺聚糖），被添加到膠原蛋白中，以改善生物墨水的可打印性。為了評估印刷環(huán)的均勻性和印刷過程的再現(xiàn)性，用多個印刷環(huán)的圖像生成重疊圖(圖2a)。

隨著膠原蛋白含量的增加，重疊圖顯示出更均勻的印刷環(huán)，邊界更光滑，其中用4.0mg/ml膠原蛋白原液制成的油墨可重復(fù)性更好(圖2a)。HA明顯改善了≥2.0 mg/ml膠原打印環(huán)的均勻性 (圖2b)。隨著膠原和透明質(zhì)酸濃度的增加，強(qiáng)度譜顯示出更小的差異。該團(tuán)隊最終選擇了由3.0 mg/ml膠原- i和3.0 mg/ml HA (CollHA3-3)組成的生物鏈進(jìn)行進(jìn)一步的研究，因為其在實際測試中，提供了最高的再現(xiàn)性以及對擠出速度的最佳控制，且打印出的環(huán)的壁厚較薄。

為了檢驗打印過程的準(zhǔn)確性，該團(tuán)隊打印了不同的幾何形狀(環(huán)形、網(wǎng)格和星形)。打印結(jié)構(gòu)具有明確的尖銳邊緣，可以準(zhǔn)確地再現(xiàn)底層3D模型(圖2c)。交替使用對比劑和不使用對比劑(同心圓或堆疊矩形)打印CollHA3-3，可以得到連續(xù)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，表明兩種油墨在跨層融合(圖2d)。

圖2 膠原蛋白/透明質(zhì)酸油墨使打印結(jié)構(gòu)穩(wěn)定

三、環(huán)形功能性心臟組織的可重復(fù)和準(zhǔn)確的3D生物打印

為了生產(chǎn)有層次結(jié)構(gòu)的組織或器官，控制細(xì)胞分布是很重要的。因此，在印刷前需要將細(xì)胞摻入油墨中。為了評估細(xì)胞的添加是否會影響墨水的可打印性，該團(tuán)隊將25 Mio/ml hiPSC-CMs加入到CollHA3-3墨水中，用以打印環(huán)狀組織。所得到的環(huán)是穩(wěn)定的，并表現(xiàn)出良好的均勻性 (圖3a)。

在組織構(gòu)建后(第0天)和制造后7天（第7天)使用鈣黃素- am /乙錠同二聚體-1（EthD-1)對打印的組織和通過滴鑄生產(chǎn)的組織進(jìn)行染色。在任何時間點，鑄型組織和打印組織的活力均無顯著差異。

在第30天通過免疫熒光染色觀察hiPSC-CMs的切片和整個組織的形態(tài)和分布。打印的hiPSC-CMs顯示出典型的肌合成α-肌動蛋白條紋，以及緩慢的骨骼肌鈣蛋白- i (ssTnI)和心臟肌鈣蛋白- i (cTnI)(圖3b)。打印組織中α-肌動蛋白的表達(dá)均勻分布(圖3c)。同時，ssTnI的表達(dá)水平向組織邊緣升高，證明了打印的hiPSC-CMs的行為與分化和鑄造的hiPSC-CMs相似，表明了打印的hiPSC-CMs生成了有組織的肌瘤，并且具有相互連接的不同成熟狀態(tài)的hiPSC-CMs。

45個打印組織中在第3天已經(jīng)表現(xiàn)出了自發(fā)的同心收縮(圖3D)。通過Fluo-4熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)和減弱反映了打印組織在收縮周期中表現(xiàn)出鈣的同步流入和流出 (圖3f)。測量不同區(qū)域的熒光強(qiáng)度可以識別出起搏中心(ROI3，圖3g)，其行為隨著時間的推移顯示出高同步性，遠(yuǎn)處區(qū)域達(dá)到熒光強(qiáng)度峰值的延遲約為100 ms(1幀)(圖3g)。這進(jìn)一步證明了hiPSC-CMs在打印組織內(nèi)形成了相互連接的網(wǎng)絡(luò)。

為了適用于作為模型系統(tǒng)或移植，工程心臟組織必須對藥物刺激表現(xiàn)出生理反應(yīng)。因此，對打印組織首先用腎上腺素能激動劑苯腎上腺素(PE)處理，然后用維拉帕米(Ver)處理（一種l型鈣通道抑制劑）。PE刺激導(dǎo)致收縮頻率翻倍，但收縮程度并無顯著變化(圖3i,j)。隨后加入維拉帕米，收縮停止(圖3i,j)。

圖3 打印hiPSC衍生的心肌細(xì)胞形成功能性心臟組織

四、打印的心臟組織對被動阻力施加同心力

為了檢驗打印的環(huán)是否可以施加類似于心臟的同心圓力，該團(tuán)隊設(shè)計并制造了由六個柔性柱組成的陣列(圖4a)。將打印的環(huán)轉(zhuǎn)移到柱陣列上，并在柱子周圍壓實，培養(yǎng)至第30天(圖4b)。在收縮周期中，打印的環(huán)能夠同步使6根柱子發(fā)生偏轉(zhuǎn)，說明它們能夠?qū)ψ枇κ┘油�心圓力。

與自由漂浮的環(huán)一樣，這些環(huán)在第3天出現(xiàn)了自發(fā)收縮。到第28天，收縮頻率在每分鐘20次左右保持穩(wěn)定，第30天略有下降(圖4c)。在第30天進(jìn)行PE和Ver處理。PE刺激顯著增加了被動機(jī)械刺激環(huán)的收縮頻率 (圖4f)。根據(jù)柱撓度計算打印組織的產(chǎn)生的力，PE刺激后產(chǎn)生的力增加(圖4g)。Ver處理顯著降低了收縮頻率和產(chǎn)生的力，24個環(huán)中有22個停止了跳動(圖4f、g)。這里打印的環(huán)所產(chǎn)生的力與僅由人類多能干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞產(chǎn)生的力相似。

圖4 打印的心臟組織對被動阻力施加同心力

五、膠原蛋白/透明質(zhì)酸墨水3D生物打印人類心臟心室功能模型

為了測試該方法是否能夠?qū)崿F(xiàn)人類心臟心室功能模型的3D生物打印，團(tuán)隊設(shè)計并打印了一個高度為14毫米，最寬處直徑為8毫米的模型(圖5a)。

心室在制造后7天達(dá)到穩(wěn)定，并發(fā)生自發(fā)的同步收縮，在培養(yǎng)過程中持續(xù)長達(dá)100天(圖5b,c)。此外，PE刺激可使培養(yǎng)30 天的打印心室模型收縮頻率加快 (圖5d)。對染色心室的分析顯示，hiPSC-CMs在第100天顯現(xiàn)出典型的α-肌動蛋白和cTnI的條紋(圖5e)。hiPSC-CMs分布在整個打印組織中，α-肌動蛋白和cTnI表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式(圖5f)。實驗表明：該組織至少可以培養(yǎng)100天。

圖5 凝膠方法使功能心室模型的3D生物打印成為可能

總結(jié)
本文展示了直接打印嵌入膠原基生物墨水的hiPSC-CMs生成功能性心臟組織的方法。以下結(jié)果可有力支持這一結(jié)論：hiPSC-CMs可以精確且可重復(fù)地3D生物打印成多種形狀的心臟組織，并形成相互連接的、自發(fā)和同步收縮網(wǎng)絡(luò)，并且可以通過藥物刺激來調(diào)節(jié)頻率；打印組織能夠?qū)�抗被動阻力發(fā)生收縮。這里開發(fā)的方法為生成復(fù)雜的功能性心臟組織開辟了新的可能性：直接打印hiPSC-CMs以及打印其他細(xì)胞類型的方法，可用于打印健康和患病的心臟模型。此外，精確放置不同心肌細(xì)胞亞型的能力，加上在生物墨水中添加導(dǎo)電材料的技術(shù)，在未來可以進(jìn)一步模擬整個組織中的動作電位傳播，以更準(zhǔn)確地復(fù)制心臟電生理。

參考文獻(xiàn)
Tilman U. Esser, Annalise Anspach, Katrin A. Muenzebrock, Delf Kah, Stefan Schrüfer, Joachim Schenk, Katrin G. Heinze, Dirk W. Schubert, Ben Fabry, Felix B. Engel*(2023). Direct 3D-bioprinting of hiPSC-derived cardiomyocytes to generate functional cardiac tissues

https://doi.org/10.1002/adma.202305911