《Biofabrication》綜述：是否可以對承重骨植入物進行 生物3D 打��？

來源： EngineeringForLife

任何組織工程支架的康復(fù)能力主要取決于以下三方面：(i) 生物力學特性，如機械特性和結(jié)構(gòu)；(ii) 化學特性，如細胞因子表達調(diào)控；(iii) 細胞反應(yīng)調(diào)控（包括細胞招募和分化）。植入物越接近原生組織，就越能修復(fù)其中的損傷。在現(xiàn)有的制造技術(shù)中，只有3D生物打印（3DBP）能令人滿意地復(fù)制宿主組織固有的異質(zhì)性。然而，3D生物打印支架通常具有較差的機械性能，因此，近年來人們對開發(fā)承重3D生物打印骨科支架的研究興趣日益濃厚。通常情況下，這些支架涉及多材料3D打印，至少包括一種生物墨水和一種承重墨水；這樣生物材料的機械和生物要求就可以分離。在所有這些研究中，確保高細胞存活率和良好的機械性能是關(guān)鍵問題。由于打印能力的限制和材料庫的限制，此類支架的 3DBP 尚處于早期開發(fā)階段，只有少數(shù)初步動物研究的研究數(shù)據(jù)可用。

來自印度馬尼帕爾大學的Sanchita Bandyopadhyay-Ghosh和來自加拿大多倫多大學的Mohini Sain團隊合作從專題角度對當前的3DBP的最先進技術(shù)進行了綜述，同時著重介紹了可用的 3DBP 技術(shù)、生物材料的可打印性、機械和降解行為，以及它們在骨組織康復(fù)方面的整體功效。本工作集綜合并批判性地分析了針對承重支架的 3DBP 研究，以滿足個性化醫(yī)療的需求。本工作重點介紹了采用熱塑性塑料和磷酸鹽水泥進行承重應(yīng)用的 3DBP 技術(shù)的最新進展。最后，本工作展望了 3DBP 在骨科承重應(yīng)用領(lǐng)域的未來前景。總之，這篇文章為未來的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)，因為它收集了科學家們可以利用的最新和正在進行的研究。相關(guān)工作以題為“Is it possible to 3D bioprint load-bearing bone implants? A critical review”的文章發(fā)表在2023年9月19日的國際著名期刊《Biofabrication》。

1. 內(nèi)容
最近的開發(fā)出了一種 “雙相支架”，其中包括與傳統(tǒng)生物墨水一起打印的機械強度（或承重）階段，從而在一定程度上復(fù)制了骨組織的原生環(huán)境。幾乎所有此類支架中的堅硬相都由低溫熔融熱塑性生物聚合物或磷酸鹽水泥組成，并配制成可擠出的糊狀物。與傳統(tǒng)的生物陶瓷不同，這些水泥可以在溫和的條件下凝固或固化。圖 1(a) 定性比較了雙相支架與生物打印和無細胞 3DP 支架的特性。雙相支架代表了3D生物打�。�3DBP）在化學和生物仿真之間的一種更好的平衡以及在細胞 3DP 支架上觀察到的機械剛度、打印分辨率和支架穩(wěn)定性。雙相支架的壓縮模量大約是傳統(tǒng) 3DBP 支架的 1000 倍（圖 1(b)）。

圖1 機械性能、超微結(jié)構(gòu)（代表形態(tài)擬態(tài)和打印分辨率）、穩(wěn)定性（在生理介質(zhì)中）的定性比較

【用于承載應(yīng)用的 3DBP 技術(shù)】

在各種技術(shù)中，基于擠壓的多材料生物打印技術(shù)（圖 2(a)和(b)）是最簡單易行的，而且可以找到相對便宜的臺式生物打印機型號，因此得到廣泛采用。然而，基于擠壓的生物打印機打印速度慢，打印分辨率低（通常大于幾百微米）。相比之下，基于 SLA 和噴墨的生物打印機理論上可以實現(xiàn)更高的生物墨水打印分辨率（通常小于 50 微米）。迄今為止，已有報道稱噴墨或 SLA 型多材料混合生物打印機采用熔融擠出技術(shù)打印熱塑性承重墨水，并通過噴墨打印頭（圖 2(d)-(f)）或 SLA 光聚合技術(shù)（圖 2(c)）打印生物墨水。

圖2 通過熔融擠出和三種生物墨水打印 PCL 的多材料 3D 生物打印機的結(jié)構(gòu)原理

【帶熱塑性塑料的 3DBP】
聚乳酸-共聚乙醇酸（PLGA）、聚乳酸（PLA）和聚苯乙烯（PCL）等熱塑性生物材料早已被公認為具有生物醫(yī)學應(yīng)用前景的材料。它們的3D打印性和生物降解性進一步提高了它們的聲譽。此外，這些生物材料還具有良好的機械性能，因此過去曾被用于工程承重組織構(gòu)建。盡管如此，原始熱塑性生物聚合物缺乏足夠的生物活性，而且 3DP 所需的溫度可能會誘發(fā)細胞毒性效應(yīng)。盡管如此，最近的文獻報道了使用熱塑性聚合物作為承重相的 3DBP 承重植入物的成功嘗試。從本質(zhì)上講，使用熱塑性聚合物對承重植入體進行 3DBP 需要熱塑性聚合物（通過熔融擠出）與至少一種生物墨水相結(jié)合的多材料 3D打印技術(shù)。

【含磷酸鹽水泥的 3DBP】
MgP 是另一類可能替代 CPC 的水泥，因為其機械強度更高，體內(nèi)固化和降解速度相對更快。Kanter 等人報告了一項在成年綿羊股骨髁上對基于硬石膏、刷狀石和 CDHA 的水泥進行為期 10 個月的比較研究。如圖 3 所示，與兩種 CaP 骨水泥相比，基于 MgP 的閃長巖骨水泥表現(xiàn)出更大的骨吸收率和相應(yīng)更高的新骨生長率。鎂磷酸鹽水泥通常包括固體鎂前體，使用可溶性磷酸鹽（如磷酸氫二銨，DAHP和磷酸氫二鉀，DKHP）固化，生成不溶性的鎂磷酸鹽水泥。

圖3 在成年綿羊股骨髁中植入 10 個月的基于硬石膏、刷石和 CDHA 的水泥樣品的生物反應(yīng)

近年來的一些研究重點是在溫和條件下打印高硬度磷酸鹽水泥基支架，使其(a)可攜帶生物分子，(b)可與活組織一起打印。這種工程解決方案有可能以整體方式復(fù)制原生骨組織，并有效修復(fù)骨組織。在此階段，本研究想說明的是，由于固化磷酸鹽水泥的高硬度，使用水泥漿作為細胞系的載體可能并不可取。圖 4 描述了用于 BTE 的基于磷酸鹽水泥的 3D 打印支架的簡化制造和植入工作流程，以及磷酸鹽水泥墨水和此類技術(shù)中使用的含細胞生物墨水的主要特征。隨后的章節(jié)將詳細討論正在開發(fā)的兩類重要的磷酸鹽水泥，以實現(xiàn)這種高硬度 BTE 支架的 3DBP。

圖4 骨組織工程中磷酸鹽水泥基3D打印支架的合成和植入典型工作流程示意圖

Ahlfeld 等人推進了制備硬質(zhì)3D生物打印雙相 BTE 支架的技術(shù)。如圖 5（a）所示，他們利用多材料共擠打印油基 CPC 油墨和攜帶間充質(zhì)干細胞（MSC）的藻酸鹽生物墨水。在打印過程中，兩相的存在并未對單個油墨的行為產(chǎn)生重大影響。支架的固化分為兩個階段：（a）在高濕度環(huán)境中固化 CPC 表面；（b）在 CaCl2 溶液中固化海藻酸鹽生物墨水和 CPC 主體。這兩個步驟旨在防止 CPC 階段形成微裂縫。將 CPC 直接浸入水浴中固化會導致殘余應(yīng)力，并在固化反應(yīng)期間形成裂縫。另一方面，最初暴露在濕氣中超過 30 分鐘會導致 CaP 逐漸沉淀。暴露表面的局部固化固定了打印支架的初始形狀。在水浴中的進一步培養(yǎng)完成了固化過程，增加了水分滲透，降低了殘余應(yīng)力，使表面沒有微裂縫，并顯著提高了打印支架的抗壓強度。總體而言，雙相支架的壓縮模量大于 30 兆帕，壓縮強度為 1.3 兆帕，均大大高于傳統(tǒng)的生物打印支架。

圖5 通過多材料共擠出生物打印進行 3DBP 的典型工作流程以及噴嘴的改進

雙相支架的體外細胞相容性顯示，在大多數(shù)生物墨水中，CPC 墨水不會引起毒性（由于油載體釋放或凝固反應(yīng)）。然而，一天后在兩種油墨的界面處觀察到大量細胞死亡（圖 6(a)）。這歸因于凝固反應(yīng)過程中氫離子的釋放。長期研究表明，細胞相容性有所改善，培養(yǎng) 21 天后，細胞在 CPC 相上大量生長，并隨之遷移和增殖（圖 6（a）和（b））。經(jīng)優(yōu)化的初始支架培養(yǎng)時間（<30 分鐘）可在細胞增殖和支架強度之間取得良好的平衡。由于藻酸鹽油墨本身的打印適性較差，打印樣品的孔隙閉合是由于無支撐的支柱塌陷造成的，可能會阻礙細胞的運動。選擇更好的生物墨水（如硬度更高的水凝膠）可能會增強3D生物打印支架的體外行為，因為這樣可以打印出更大的孔，最大限度地減少 CPC 與生物墨水之間的界面，并相應(yīng)地提高支架培養(yǎng)初期的細胞存活率。此外，這項工作還通過開發(fā)患者特異性生物墨水得到了擴展，將直接取自患者的血漿融入其中。通過這種方法向缺損部位輸送免疫調(diào)節(jié)蛋白，有望引起有利的免疫反應(yīng)，增強受損組織的愈合能力。

圖6 基于CPC和藻酸鹽生物墨水的雙相3D打印支架的體外結(jié)果顯示

【對 3DBP 承重生物材料的嚴格評價】

由于 CaP 基 3DP 油墨與原生骨的礦物相類似，因此在開發(fā)承重 3DBP 支架方面，對 CaP 基 3DP 油墨的研究相對多于鎂基 3DP 油墨。CaP 墨水的生物降解發(fā)生在（a）溶液驅(qū)動的溶解和（b）破骨細胞介導的吸收（圖 7(a)）。在固化 CPC 中發(fā)現(xiàn)的兩個主要相中，磷灰石相是生理 pH 值下熱力學上最穩(wěn)定的相。因此，它們主要通過破骨細胞活動被吸收。盡管這種吸收相對要慢得多，但破骨活動會形成獨特的 “豪西普裂隙”。由于其有利的界面，這些吸收部位可以成為新骨形成的熱點。此外，CPC 中的離子置換已被證明可控制破骨細胞的活性，即Sr2+ 離子可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP 1 和 2）的分泌來抑制破骨細胞的活性。因此，吸收的減少有助于提高整體骨修復(fù)率。另外，碳酸根離子取代的磷灰石顯示出更快的降解潛力，從而加速了吸收過程。順便提一下，Innotere 小組報告的 3D 打印 CaP 墨水中含有一定量的碳酸鈣，從而緩解了 CDHA 降解速度慢的問題。圖 8 總結(jié)了文獻中報道的用于開發(fā)骨科用承重 3DBP 支架的各類材料（承重生物材料墨水和生物墨水）和生物打印技術(shù)。

圖7 CaP 生物材料植入后的命運以及 PCL 中觀察到的降解模式

圖8 承重 3D 生物打印材料和生物打印方法概述

當然，為了開發(fā)有效的 BTE 支架，需要研究骨生物礦化的相關(guān)機制。在原生骨中，礦化過程以軟骨內(nèi)骨化為主。雖然膠原基質(zhì)是礦物質(zhì)沉積的模板，但人們普遍認為非膠原蛋白（NCP），包括糖蛋白和蛋白聚糖在調(diào)節(jié)生物礦化過程中起著至關(guān)重要的作用。除了在膠原纖維的間隙區(qū)域引導礦物相的自組裝之外。NCP 帶有大量負電荷，可與無定形磷酸鈣（ACP）形成蛋白質(zhì)-礦物質(zhì)復(fù)合物。這些帶負電荷的復(fù)合物具有以下優(yōu)點：(i) 可防止 HA 在間隙部位沉淀，(ii) 為 ACP 在纖維內(nèi)向膠原縫隙區(qū)帶正電荷的 N 端滲透提供靜電勢。圖 9 展示表示了這一機制，并附有未礦化和完全礦化膠原纖維的 TEM 圖像。

圖9 NCP 介導的膠原蛋白礦化的圖示和具有 ACP 復(fù)合物的未礦化膠原原纖維的 TEM 圖像

【展望未來】

相比之下，使用 CaP 粘合劑進行 3D 打印則面臨不同的挑戰(zhàn)，例如，由于水介質(zhì)的打印窗口較短，因此不能可靠地用作載體介質(zhì)。因此，有一些涉及油基 CPC 油墨的研究報告稱，這種油墨與含有細胞的生物墨水一起打印時具有極佳的可打印性。雖然這些研究顯示了良好的細胞相容性和體外培養(yǎng)過程中出色的細胞增殖能力，但迄今為止還沒有研究能夠證明這種雙相支架的再生能力。Ahlfeld 等人在最近的一項研究中嘗試在 Lewis 大鼠的顱面缺損中測試雙相 CPC 支架的體內(nèi)修復(fù)能力，結(jié)果令人欣喜（圖 10）。然而，由于打印技術(shù)的分辨率限制，作者未能使用多通道打印技術(shù)打印出足夠小的部件。解決這一問題的可能替代方法是使用多軸核/殼打印技術(shù)，Raja 和 Yun 在其他地方也報告了這一方法。盡管如此，多材料擠壓3D打印的低打印分辨率問題依然存在，并對復(fù)雜解剖形狀部件的3D生物成型技術(shù)提出了巨大挑戰(zhàn)。

圖10 從顯微計算機斷層掃描數(shù)據(jù)獲得的重建圖像、熒光圖像以及外植體組織切片的光學顯微鏡圖像

2. 總結(jié)
3DBP 因其卓越的再生能力而在生物醫(yī)學工程領(lǐng)域得到廣泛認可。然而，3DBP 支架的機械性能和穩(wěn)定性較差是其顯著的缺點，也是其轉(zhuǎn)化研究的主要挑戰(zhàn)。在現(xiàn)有的制造技術(shù)中，承重 3DBP 支架已成為一種可行的解決方案，它可以仿生本地組織的異質(zhì)性，同時改善骨科應(yīng)用中組織工程構(gòu)建物的機械性能。用于承重應(yīng)用的 3DBP 可以理解為 “多材料” 3D 打印，其中至少有一種打印墨水是承重相，與其他生物墨水一起進行 3D 打印，從而使承重相的打印和凝固/固化過程在溫和的條件下進行，而不會對打印的活組織和生物分子的活力產(chǎn)生不利影響。嚴格的材料和加工要求嚴重限制了可使用的承重生物材料油墨類型。迄今為止，只有熱塑性塑料和磷酸鹽水泥基油墨被報道為可行的候選材料，其中磷酸鹽水泥基油墨因其成骨性、高硬度和優(yōu)異的降解性能而成為近年來的首選。盡管如此，該領(lǐng)域仍處于早期發(fā)展階段，在嘗試臨床試驗之前，需要解決打印分辨率低、材料庫有限、機械強度不達標等挑戰(zhàn)。具備高度多學科技能的實驗室和監(jiān)管協(xié)議的建立對于將此類3D生物打印承重支架轉(zhuǎn)化為臨床實踐至關(guān)重要。本綜述旨在整合不同領(lǐng)域的相關(guān)信息，從而為支持該領(lǐng)域的未來研究奠定基礎(chǔ)。總之，本綜述相信承重式 3DBP 有足夠的潛力來應(yīng)對個性化醫(yī)療中尚未解決的挑戰(zhàn)，從而實現(xiàn)高效的骨康復(fù)。隨著時間的推移，預(yù)計該技術(shù)將足夠成熟，能夠在臨床環(huán)境中修復(fù)骨組織缺損以及進行全骨置換。

文章來源：

https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/acf6e1