來源: EngineeringForLife
類器官通過提供類似于體內(nèi)的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能有可能徹底改變體外疾病建模。然而,由于繁瑣的類器官分化過程和難以擴(kuò)大培養(yǎng)及質(zhì)量控制的困難,這種不斷創(chuàng)新和發(fā)展的技術(shù)仍然需要分析通量和可重復(fù)性,以實(shí)現(xiàn)化合物的高通量篩選(HTS)。由于缺乏與相對較大的類器官兼容且易于使用的流體系統(tǒng),將類器官用于HTS受到進(jìn)一步挑戰(zhàn)。在這里,美國北德克薩斯大學(xué)Moo-Yeal Lee與辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)療中心Takanori Takebe、 James M. Wells通過“微陣列三維(3D)生物打印”技術(shù)以及用于人體類器官培養(yǎng)和分析相關(guān)柱和灌注板來克服這些挑戰(zhàn)。將高精度、高通量干細(xì)胞打印和封裝技術(shù)、柱板與互補(bǔ)的深孔板和灌注孔板相結(jié)合用于靜態(tài)和動態(tài)類器官培養(yǎng)。將水凝膠中的生物打印細(xì)胞和球狀體分化為肝和腸類器官,用于原位功能分析。柱狀/灌注板與標(biāo)準(zhǔn)的384孔板和HTS設(shè)備兼容,因此在目前的藥物發(fā)現(xiàn)工作中易于采用。
相關(guān)研究內(nèi)容以“A Pillar and Perfusion Plate Platform for Robust Human Organoid Culture and Analysis”為題于2023年8月24日發(fā)表在《Advanced Healthcare Materials》。
640 2.jpg (65.36 KB, 下載次數(shù): 182)
下載附件
2023-9-4 09:33 上傳
圖1 微陣列3D生物打印技術(shù)及相關(guān)柱及灌注板平臺
由于開發(fā)的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)無法滿足需求,本研究開發(fā)了微陣列3D生物打印技術(shù)和相關(guān)的柱/灌注板。微陣列3D生物打印是一種微電磁閥驅(qū)動、高精度的機(jī)器人細(xì)胞打印技術(shù),可以以最小的人工干預(yù)快速、重復(fù)地創(chuàng)建人體類器官(圖1)。
640-1.jpg (99.54 KB, 下載次數(shù): 201)
下載附件
2023-9-4 09:33 上傳
圖2 柱板和深孔板的組合用于靜態(tài)類器官培養(yǎng)
一個384柱板包含384個柱,使用3D生物打印機(jī)或多通道移液管分配懸浮在水凝膠中的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)(圖2)。柱間距4.5 mm,柱高11.6 mm的384柱板是通過注塑成型制成的(圖2A)?组g距4.5 mm、寬3.5mm、深14.7 mm的384深孔板采用注塑制造(圖2B)。
640-2.jpg (132.6 KB, 下載次數(shù): 191)
下載附件
2023-9-4 09:33 上傳
640.jpg (42.81 KB, 下載次數(shù): 232)
下載附件
2023-9-4 09:33 上傳
圖3 將柱板和灌注孔板相結(jié)合進(jìn)行動態(tài)類器官培養(yǎng)
除了384柱板和384深孔板,36柱板和36灌注板都建立在傳統(tǒng)的384孔板上,用聚苯乙烯注射成型進(jìn)行動態(tài)類器官培養(yǎng)(圖3)。模擬36灌注板中夾有36柱板的灌注孔和儲層水位隨時間的變化,以避免溢流(圖3F)。在灌注孔的柱下發(fā)現(xiàn)高速分布,這可能導(dǎo)致柱下的高流體混合,并加速柱上的細(xì)胞生長(圖3G、I)。
640-1 2.jpg (132.44 KB, 下載次數(shù): 171)
下載附件
2023-9-4 09:33 上傳
圖4 柱板上的生物打印人肝臟類器官(HLOs)
為了成功地將iPSCs分化為類器官并證明其在柱/灌注板中的功能,選擇不同分化階段的iPSCs、仿生水凝膠和含有特定生長因子和添加劑的生長介質(zhì)是至關(guān)重要的。本研究證明了人肝類器官(HLOs)和人腸類器官(HIOs)分別從懸浮在柱板上的海藻酸鹽和基質(zhì)膠混合物中的前腸細(xì)胞和柱板上的中后腸細(xì)胞球體中的分化。從形態(tài)學(xué)上看,在柱板和24孔板上培養(yǎng)的HLOs與內(nèi)腔被間充質(zhì)細(xì)胞包圍的圓形上皮細(xì)胞層相似(圖4A、B)。成熟的HLOs大小為0.1~0.2mm;維甲酸(RA)處理后,維甲酸基質(zhì)膠(對照)的間充質(zhì)細(xì)胞正常生長,而海藻酸鹽和基質(zhì)膠混合物的間充質(zhì)細(xì)胞生長顯著減少(圖4C)。
640-3.jpg (66.43 KB, 下載次數(shù): 201)
下載附件
2023-9-4 09:33 上傳
640.jpg (37.09 KB, 下載次數(shù): 206)
下載附件
2023-9-4 09:38 上傳
圖5 柱板上靜態(tài)培養(yǎng)的HLOs功能
通過評估類器官形態(tài)、白蛋白分泌和肝臟生物標(biāo)志物的免疫熒光染色比較冷凍前腸細(xì)胞在水凝膠打印在24孔板中分化的HLOs。白蛋白分泌數(shù)量在三個不同的條件下幾乎是相同的(圖5A)。在36柱板上生成HLOs后,通過免疫熒光染色檢測到HLOs中肝細(xì)胞標(biāo)記物肝細(xì)胞核因子-4α(HNF4α)和上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-鈣粘蛋白的表達(dá)(圖5B)。在柱板上培養(yǎng)的HLOs(圖5B中間)與在24孔板上培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)板中培養(yǎng)的表達(dá)沒有差異(圖5B為底部)。除了白蛋白的分泌外,通過測量36柱板上的膽汁酸攝入量,證明了HLOs的顯微解剖特征(圖5C)。
640-2 2.jpg (45.27 KB, 下載次數(shù): 189)
下載附件
2023-9-4 09:33 上傳
640-1.jpg (78.45 KB, 下載次數(shù): 196)
下載附件
2023-9-4 09:38 上傳
圖6 用化合物處理柱板上靜態(tài)培養(yǎng)的HLOs
通過將HLOs暴露于36灌注板中的脂肪酸72小時,成功地模擬脂肪性肝炎(圖6A-C)。通過BODIPY-based脂質(zhì)染色和圖像分析評估HLOs中脂質(zhì)積累的能力(圖6A)。進(jìn)一步的高倍共聚焦成像顯示,經(jīng)油酸處理后,HLOs的細(xì)胞質(zhì)中積累了脂質(zhì)滴(圖6B、C)。為了評估藥物誘導(dǎo)的肝損傷(DILI),將帶有HLOs的36柱板夾在含有萘法唑酮的36灌注板上孵育72小時(圖6D-F)。藥物暴露后,通過將36柱板分離并將其夾在一個含有鈣綠素AM和乙型二聚體-1的384深孔板上來測量HLOs活力(圖6E),柱子上的綠點(diǎn)和紅點(diǎn)分別代表活細(xì)胞和死細(xì)胞,萘法唑酮濃度的增加導(dǎo)致細(xì)胞活力下降。使用細(xì)胞滴度-Glo®發(fā)光細(xì)胞活力檢測試劑盒測定萘法唑酮的劑量反應(yīng)曲線和半抑制濃度值,結(jié)果顯示細(xì)胞活力以萘法唑酮的劑量依賴性方式下降(圖6F)。
640-4.jpg (80.88 KB, 下載次數(shù): 175)
下載附件
2023-9-4 09:33 上傳
圖7 通過將單個中后腸細(xì)胞球狀體從超低附著體(ULA)384孔板轉(zhuǎn)移到384柱板上,人腸類器官(HIOs)在柱板上均勻分化
中后腸細(xì)胞球狀體在40天的過程中分化為HIOs(圖7A)。HIO在柱板上分化成熟40天后,在柱板上建立類器官原位成像,顯示腸上皮發(fā)育和細(xì)胞-細(xì)胞緊密連接形成(圖7B、C)。在靜態(tài)培養(yǎng)中,正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)的HIOs分泌非常一致,且具有高度重復(fù)性(圖7D)。而HIOs在36柱板上培養(yǎng)4周后,柱板上8 ~14 %的HIOs因蛋白酶分泌的基質(zhì)凝膠降解而分離,5~11 %的中后腸聚集物由于細(xì)胞數(shù)量少而沒有正常分化為HIOs(圖7E)。即使當(dāng)附著在柱板上的HIOs的CV值低于25%時,也能實(shí)現(xiàn)均勻生長(圖7D、F)。為了研究HIOs是否對像人類腸道一樣的營養(yǎng)水平有反應(yīng),使用36柱板/36灌注板系統(tǒng)來動態(tài)控制柱上葡萄糖水平,從3mM(禁食)到20mM(喂養(yǎng))(圖7G)。這些結(jié)果表明,可以通過將球狀體轉(zhuǎn)移到柱板上,并通過原位成像或使用簡單的流體方式實(shí)時監(jiān)測類器官,從而可擴(kuò)展地生成均勻類器官。
綜上,本研究通過聚苯乙烯注射成型成功制造柱/灌注板,并通過功能分析演示靜態(tài)和動態(tài)的HLO和HIO培養(yǎng)。柱/灌注板通過支持深孔板中生長介質(zhì)的靜態(tài)培養(yǎng)或生長介質(zhì)通過灌注孔板的動態(tài)培養(yǎng)維持生物打印單細(xì)胞懸浮在海藻酸鹽和基質(zhì)凝膠的混合物中,以及基質(zhì)凝膠中的細(xì)胞球體的長期類器官培養(yǎng)。開發(fā)的細(xì)胞打印和封裝方案具有高度的靈活性,允許在柱板上的基質(zhì)凝膠中培養(yǎng)多種類器官,從而為化合物潛在的器官特異性毒性提供了更多的見解。本研究在柱/灌注板上展示的微陣列3D生物打印技術(shù)代表了一種獨(dú)特的策略,即快速地在仿生水凝膠中打印PSCs和類器官。柱/灌注板平臺上的類器官可以通過模擬體內(nèi)微環(huán)境再現(xiàn)組織發(fā)育并維持高組織功能。此外,可以通過高通量、高含量的類器官分析在體外進(jìn)行復(fù)制和闡明化合物的組織功能和機(jī)制作用。將生物打印的類器官與高含量的全類器官成像相結(jié)合,以更好地了解生成的類器官的功能和化合物的細(xì)胞毒性。因此,微陣列生物3D打印技術(shù)可以解決類器官研究中未滿足的需求,通過結(jié)合柱板上PSCs的快速打印,在靜態(tài)和動態(tài)培養(yǎng)中分化和成熟為類器官,模擬人體組織的生理微環(huán)境,同時顯著提高吞吐量和可操作性,以預(yù)測化合物的篩選。本研究設(shè)想在柱/灌注板中生物打印的類器官可以為化合物的臨床前評估或優(yōu)先考慮環(huán)境毒物提供高度預(yù)測的毒性和有效性信息。因此,本研究中獨(dú)特的方法可以為HTS的類器官檢測提供廣泛的工業(yè)應(yīng)用。
文章來源:
https://doi.org/10.1002/adhm.202302502
|