擴(kuò)展嵌入式3D生物打印功能，利用自由形式血管網(wǎng)絡(luò)工程復(fù)雜器官

來源： 上普生物

在體外按需創(chuàng)造功能性的組織和器官是增材制造的一個(gè)主要目標(biāo)，但是復(fù)制組織和特定器官的外部幾何形狀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，例如血管，仍是研究最大障礙之一。近日，一篇名為“Expanding Embedded 3D Bioprinting Capability for Engineering Complex Organs with Freeform Vascular Networks”的文章由清華大學(xué)的孫偉教授和熊卓教授團(tuán)隊(duì)，發(fā)表在ADVANCED MATERIALS（IF=32.086）上。該研究開發(fā)一種可推廣的在可逆墨水中順序打印的生物打印策略（SPTRIT），利用一種基于微凝膠的雙相生物墨水作為懸浮介質(zhì)，利用SPIRIT策略可以有效打印具有可灌注血管網(wǎng)絡(luò)的心室模型。結(jié)果證明SPIRIT技術(shù)可以更快的打印復(fù)雜的器官幾何形狀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，此技術(shù)將加速組織和器官的生物制造和在治療上的應(yīng)用。

背景介紹
在構(gòu)建復(fù)雜的自由形式結(jié)構(gòu)方面，嵌入式3D打印技術(shù)擁有很高的優(yōu)勢。在這種方法中，是將載有細(xì)胞的生物墨水打印到可犧牲的懸浮介質(zhì)中，懸浮介質(zhì)用于支持交聯(lián)前的生物墨水在3D空間中的沉積，由于其獨(dú)特的剪切變稀和自愈特性，懸浮介質(zhì)在屈服應(yīng)力下快速流化，在沒有應(yīng)力的情況下凝固。這種技術(shù)稱為FRESH技術(shù)。另一種構(gòu)建血管高仿生度的血管網(wǎng)絡(luò)技術(shù)是以任意方式將犧牲生物墨水打印到載有細(xì)胞的懸浮介質(zhì)中。這種技術(shù)稱為SWIFT技術(shù)。但是以上兩種方式均存在缺陷，本項(xiàng)目是開發(fā)一種在可逆墨水模版中順序打印的技術(shù)，將兩種技術(shù)結(jié)合，稱之為SRIRIT技術(shù)。該技術(shù)包括以下幾個(gè)階段：

第一步：在可逆懸浮介質(zhì)中打印生物墨水，以生成天然組織和器官的復(fù)雜外部幾何結(jié)構(gòu)。

第二步：將犧牲墨水打印到初次打印但未交聯(lián)的結(jié)構(gòu)中，生成自由形式的血管網(wǎng)絡(luò)。

第三步：原位光交聯(lián)保證打印結(jié)構(gòu)的完整性，并去除懸浮介質(zhì)和犧牲墨水。

實(shí)驗(yàn)過程與結(jié)果
載有hiPSC細(xì)胞的MB生物墨水的制備和性能表征
本項(xiàng)目中，hiPSC封裝在明膠/海藻酸鈉水凝膠中，制備出微凝膠，粒徑在200-230μm，通過清洗和離心去除多余液體，之后與GelMA水凝膠混合分別作為微凝膠相和水凝膠相。制備出基于微凝膠的生物墨水（MB），交聯(lián)后，hiPSC活性為下降至45.8%±6.4%，剪切力對細(xì)胞活力有負(fù)面影響。HiPSC繼續(xù)增殖，傾向于生常委細(xì)胞聚集體，也稱胚狀體（EB）。EB的直徑隨著培養(yǎng)時(shí)間增加而增加。培養(yǎng)8天后，通過免疫熒光檢測和流式檢測，證明在支架中，hiPSC維持多能性。在誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞后，能觀察到心肌細(xì)胞跳動，說明hiPSC成功分化為心肌細(xì)胞。

MB墨水嵌入式生物3D打印用于制備復(fù)雜結(jié)構(gòu)
本研究測試了兩種懸浮介質(zhì)，一種是上普公司生產(chǎn)的懸浮膠，一種是用直徑小雨7μm的明膠微粒基懸浮介質(zhì)。這兩種懸浮介質(zhì)都具有剪切變稀性和自愈性。上普公司生產(chǎn)的懸浮膠具有光學(xué)成像優(yōu)勢和原位打印優(yōu)勢。明膠微粒基懸浮膠具有生物相容性和高溫易去除的特點(diǎn)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)主要用上普公司生產(chǎn)的懸浮膠。

通過測定打印參數(shù)中擠出量與絲徑的關(guān)系，從而找到較合適的擠出量。通過在打印的碗中加墨水，和在支氣管模型中灌墨水，從而確認(rèn)MB墨水在懸浮介質(zhì)中嵌入式打印后可以制備出結(jié)構(gòu)完整度的模型，各個(gè)方向的細(xì)絲之間存在緊密的互連性。通過循環(huán)拉伸確定了MB嵌入式打印支架具有機(jī)械穩(wěn)健性。嵌入式MB打印比普通的打印方式樣品的彈性模量多2倍，這種差異的部分原因是嵌入式打印的樣品沒辦法達(dá)到100%填充。

通過檢測打印后HepG2細(xì)胞的死活染色和細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)HepG2載入到MB墨水，并嵌入式打印后，細(xì)胞活性要比直接載入到gelma墨水中，活性要低。這可能是因?yàn)榇蛴∵^程中的剪切應(yīng)力造成的。

用犧牲墨水在MB墨水懸浮介質(zhì)中打印自由形式的血管
經(jīng)過測試，打印機(jī)擠出速度和絲徑呈現(xiàn)線性關(guān)系，打印血管時(shí)通過控制犧牲墨水打印的擠出量從而調(diào)整懸浮膠中孔徑。將HUVEC細(xì)胞打印在支架中，可以觀察到HUVEC均勻分布在整個(gè)模版化通道中，細(xì)胞增殖后，在通道中形成均勻、融合的內(nèi)皮層。

SPTRIT打印原理和特點(diǎn)
MB生物墨水具有非常好的流變性，可以作為懸浮介質(zhì)。

SPIRIT技術(shù)包括以下幾個(gè)過程：

將MB生物墨水打印上普公司購買的懸浮膠或者明膠微粒懸浮介質(zhì)中，以生成復(fù)雜的外部結(jié)構(gòu)，例如腔室；

在第一次打印完成后，將犧牲墨水（F-127或者明膠）打印到初次打印但是未交聯(lián)的MB墨水結(jié)構(gòu)中；

通過原位光交聯(lián)保證打印結(jié)構(gòu)的完整性；

去除懸浮介質(zhì)和犧牲墨水。

與目前的3D生物打印方法相比，SPIRIT技術(shù)有可能制備出外部幾何形狀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)方面都非常復(fù)雜的組織和器官。下圖中i圖展示打印后，在管道中灌注藍(lán)色墨水，可以看到液體的液體流動。并且自由形式的打印比以往的層層打印方式，打印時(shí)間更短。

SPIRIT技術(shù)打印帶有自由形式血管網(wǎng)絡(luò)的心室
心臟是一個(gè)空心的腔室器官，具有非常密集的血管網(wǎng)絡(luò)，以滿足其高氧氣需求。本項(xiàng)目中創(chuàng)建了一個(gè)簡化的心室模型，直徑為2cm，壁厚為4mm，并在心室模型中間構(gòu)建了分層的血管網(wǎng)絡(luò)。試驗(yàn)中使用了上普懸浮膠作為可視化SPIRIT打印過程，用MB生物墨水先打印了心室結(jié)構(gòu)，之后用明膠作為犧牲墨水，打印了血管網(wǎng)絡(luò)。通過固定打印速度，改變擠出速率來調(diào)整每個(gè)分支的直徑，成功嵌入了分層血管網(wǎng)絡(luò)的心室結(jié)構(gòu)。需要注意的是，血管網(wǎng)絡(luò)打印順序需要從下到上分配打印順序，避免攪動或破壞MB生物墨水打印的圖案，通過與注射泵連接反復(fù)灌注心室內(nèi)的每個(gè)分層血管網(wǎng)絡(luò)。

確保SPIRIT技術(shù)可以打印血管網(wǎng)絡(luò)后，課題組又設(shè)計(jì)了一種更復(fù)雜可灌注的血管網(wǎng)絡(luò)，可以密集填充心室模型。如圖所示，實(shí)驗(yàn)室成功打印了一個(gè)具有3D曲折度和不同直徑的致密血管網(wǎng)絡(luò)，類似于冠狀動脈血管樹形態(tài)。活/死染色加過所示，打印血管網(wǎng)絡(luò)在體外培養(yǎng)過程中極大地促進(jìn)了打印組織的活力。免疫熒光染色正式了肌節(jié)的存在和細(xì)胞相互連接，表明打印心室的初步成熟。這些結(jié)果展示了打印組織的正常功能。

結(jié)論和展望
該研究中介紹了基于MB生物墨水的SPIRIT打印策略的概念，這種打印方式被證明MB生物墨水是非常適合作為嵌入式生物打印的懸浮介質(zhì)。MB生物墨水可以通過負(fù)載hiPSCs，通過細(xì)胞增殖和分化，可以構(gòu)建特定器官組織。例如可以用過打印一個(gè)具有自由形式血管網(wǎng)絡(luò)的心室模型，提高氧氣運(yùn)輸效率，從而提高細(xì)胞活力。這種打印方式可以推廣到其他具有剪切變稀和自修復(fù)的水凝膠中，可以輕松構(gòu)件嵌入式內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜組織機(jī)構(gòu)，并且打印時(shí)間大大縮短�？梢约铀偕�物制造用于組織工程和醫(yī)療上的應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)
Yongcong F, Zhuo X, et al. Expanding Embedded 3D Bioprinting Capability for Engineering Complex Organs with Freeform Vascular Networks. Advanced Materials, 16 February 2023.
https://doi.org/10.1002/adma.202205082