清華大學(xué)王秀梅教授團(tuán)隊(duì)在Bioactive Materials|生物3D打印神經(jīng)樣纖維可以改善生態(tài)...

生物3D打印在以自下而上的裝配方式制造仿生活性結(jié)構(gòu)體方面具有巨大的前景。近日，一篇名為“3D bio-printed living nerve-like fibers refine the ecological niche for long-distance spinal cord injury regeneration”的文章由清華大學(xué)的王秀梅教授研究團(tuán)隊(duì)在Bioactive Materials (IF=16.87)上發(fā)表。該文章通過基于擠壓式生物3D打印技術(shù)制備了活體神經(jīng)樣纖維用于脊髓損傷治療。活體神經(jīng)樣纖維由神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)組成，大量神經(jīng)干細(xì)胞被包裹在一種模擬細(xì)胞外間質(zhì)(ECM)的水凝膠內(nèi)，組裝成一種高度空間有序的結(jié)構(gòu)，形似于密集排列的神經(jīng)纖維束。通過4mm大段完全橫斷脊髓損傷大鼠模型測試了活體神經(jīng)樣纖維的促神經(jīng)發(fā)生能力。研究顯示，活體神經(jīng)樣纖維通過免疫調(diào)節(jié)、血管生成、神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)中繼形成和神經(jīng)回路重塑來改善缺陷部位的生態(tài)微環(huán)境，完成了出色的功能重建，揭示了植入后活性結(jié)構(gòu)的演變過程，為脊髓損傷的臨床治療提供了新思路。

背景介紹

脊髓損傷是一極為嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)破壞，可能導(dǎo)致永久性運(yùn)動(dòng)和感覺功能障礙，給患者帶來巨大的身體和心理痛苦還有沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。為了恢復(fù)脊髓損傷后被破壞的神經(jīng)功能，臨床上使用了包括手術(shù)，藥物，細(xì)胞治療，生物材料植入和物理刺激在內(nèi)的巨大努力致力于重建神經(jīng)回路和損傷后的神經(jīng)元通信，但效果仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能令人滿意。治療效果有限的主要原因是損傷部位的不利于生態(tài)微環(huán)境逐漸形成，伴隨著內(nèi)源性促進(jìn)劑不足，神經(jīng)元丟失，軸突惡化和脫髓鞘，缺血，神經(jīng)炎癥和膠質(zhì)瘢痕形成等一系列病理事件。因此，如何改善整個(gè)損傷部位的生態(tài)微環(huán)境已被視為脊髓損傷治療的關(guān)鍵戰(zhàn)略目標(biāo)。

在過去的二十年中，神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)移植已經(jīng)成為一個(gè)令人鼓舞的脊髓損傷治療方案，因?yàn)樯窠?jīng)原性和神經(jīng)保護(hù)的雙重功能。人們普遍認(rèn)為，植入的具有自主分化能力的NSCs可以補(bǔ)充受損的細(xì)胞，并分泌大量的神經(jīng)營養(yǎng)因子作為活的“生物工廠”來滋養(yǎng)微環(huán)境，產(chǎn)生新生的神經(jīng)回路和進(jìn)一步修復(fù)功能。此外，植入的神經(jīng)干細(xì)胞可以誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞遷移到病變部位以促進(jìn)脊髓再生。盡管神經(jīng)干細(xì)胞移植是一種有效的修復(fù)策略，但它通常面臨不利于生存的炎癥微環(huán)境，導(dǎo)致留存率低，細(xì)胞存活率低，遷移分化不受控制等安全性問題，大大減少了治療效果。值得注意的是，體內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞位于一個(gè)特定的三維(3D)微環(huán)境，其中包括與相鄰細(xì)胞、可溶性因子和細(xì)胞外間質(zhì)(ECM)的高度活躍的相互作用，為NSC粘附提供結(jié)構(gòu)支持，并為調(diào)節(jié)細(xì)胞功能和基質(zhì)沉積的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)提供平臺(tái)。脊髓損傷后，典型的 ECM 結(jié)構(gòu)和功能受到嚴(yán)重破壞。因此，生物材料支架作為一種人工細(xì)胞外基質(zhì)是必不可少的，以重建有利微環(huán)境和調(diào)節(jié)細(xì)胞群組織再生。以生物材料為基礎(chǔ)的干細(xì)胞移植作為一種有希望的脊髓損傷治療方法已經(jīng)受到廣泛關(guān)注，該方法有助于在移植后調(diào)節(jié)干細(xì)胞功能，并避免細(xì)胞治療的缺點(diǎn)。

圖1. 生物3D打印活體神經(jīng)樣纖維和新生功能網(wǎng)絡(luò)體內(nèi)重塑的示意圖。

生物墨水的選取與表征

考慮到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的天然 ECM 成分，該文章設(shè)計(jì)了一種明膠和透明質(zhì)酸組成的混合水凝膠，以創(chuàng)建特定的生態(tài)微環(huán)境。將明膠和透明質(zhì)酸分子骨架與甲基丙烯�；�進(jìn)行化學(xué)功能化，合成了接枝度分別為60%和18%的 GelMA和HAMA。該材料可以通過光聚合后的碳-碳雙鍵(1640cm-1)共價(jià)共軛在一起，形成一個(gè)混合網(wǎng)絡(luò)。GelMA(5%w/v)和 HAMA(1%w/v)的復(fù)合材料在25-28°C 附近表現(xiàn)出明顯的熱響應(yīng)行為與粘度的急劇下降，證明其溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變?cè)?8°C，同時(shí)，材料體系在28°C 時(shí)表現(xiàn)出典型的剪切變稀行為，這對(duì)于保護(hù)打印過程中的細(xì)胞免受剪切力損傷是必要的。此外，GelMA/HAMA 溶液在紫外線(UV)照射下可發(fā)生快速凝膠化過程。因此，生物墨水具有良好的可打印性，結(jié)合溫敏交聯(lián)和光交聯(lián)，可以很容易地制造各種高精度結(jié)構(gòu)體。

圖2. 支架的制造與表征。A-C)各種3D 打印結(jié)構(gòu)。D)3D 打印網(wǎng)格。

E-F)3D 打印支架的掃描電鏡圖像。G-H)用平行線性陣列組裝的支架。

載神經(jīng)干細(xì)胞生物墨水的生物3D打印和表征

從胚胎 SD大鼠的海馬體中分離出神經(jīng)干細(xì)胞，并用巢蛋白抗體進(jìn)行鑒定。為了評(píng)估3D 生物打印后 GelMA/HAMA 中NSC的細(xì)胞活性和功能，制備高細(xì)胞密度(107/mL)的 NSC 載體生物墨水，并在進(jìn)行生物3D打印以形成活性結(jié)構(gòu)體，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過 Live/Dead 染色測定在體外評(píng)估構(gòu)建體內(nèi) NSCs 的活力，其在打印后結(jié)構(gòu)體極高的活性(94.69%±2.35%) ，并且在7天后仍然可以維持高活性水平。為了追蹤包裹在活體結(jié)構(gòu)體中的神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)，研究在3天的細(xì)胞培養(yǎng)后進(jìn)行了細(xì)胞骨架染色。結(jié)果表明，GelMA/HAMA 水凝膠能明顯拉長絲狀偽足，為神經(jīng)干細(xì)胞的粘附和擴(kuò)散提供了合適的生態(tài)微環(huán)境。此外，用 RT-PCR 監(jiān)測神經(jīng)干細(xì)胞的分化行為。神經(jīng)干細(xì)胞的干細(xì)胞特異性基因巢蛋白和 SRY-box 轉(zhuǎn)錄因子2(Sox2)在含有增殖培養(yǎng)基的3D水凝膠中的表達(dá)遠(yuǎn)高于其他組的神經(jīng)干細(xì)胞，表明3D水凝膠可以在無血清環(huán)境中維持神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新和多能性。相比于不含生長因子的平面培養(yǎng)，水凝膠中的神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)了更高的神經(jīng)元特異性基因 βIII 微管蛋白(Tuj-1)，和更低的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)。同時(shí)進(jìn)行免疫熒光染色以觀察神經(jīng)干細(xì)胞在三維水凝膠內(nèi)的分化行為(圖3 d-f) 。更多的 Tuj-1陽性神經(jīng)元和相對(duì)較少的 GFAP 陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞在水凝膠內(nèi)產(chǎn)生，三維環(huán)境賦予了被包裹的神經(jīng)干細(xì)胞狀態(tài)依賴性的細(xì)胞行為，以調(diào)節(jié)干細(xì)胞維持和神經(jīng)元分化的協(xié)調(diào)性。此外，細(xì)胞內(nèi)的鈣信號(hào)在細(xì)胞功能和各種神經(jīng)元的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起著關(guān)鍵作用。為了確定從神經(jīng)干細(xì)胞分化出來的神經(jīng)元是否在3D 結(jié)構(gòu)中起作用，研究在培養(yǎng)2周后進(jìn)行了 Fou-4鈣成像測試。將細(xì)胞與Fou-4 染料孵育后，用共聚焦顯微鏡監(jiān)測熒光強(qiáng)度，并記錄其對(duì)谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)的反應(yīng)。在添加谷氨酸67秒后捕獲鈣瞬變，這表明神經(jīng)元功能活躍，能夠通過自發(fā)活動(dòng)傳遞信號(hào)。作為一種活性結(jié)構(gòu)體，神經(jīng)干細(xì)胞3D 水凝膠有望為其他神經(jīng)元的粘附和生長提供一個(gè)合適的生態(tài)微環(huán)境，這可能會(huì)顯著影響宿主和移植物之間的整合。

圖3. 載有神經(jīng)干細(xì)胞的生物3D打印體及表征。A)培養(yǎng)0天的生物3D打印載 NSCs 水凝膠的活(綠色)/死(紅色)染色圖像。B)在第0天(2小時(shí)) ，第1天，第3天和第7天培養(yǎng)的生物3D打印的 NSC 載體水凝膠中的細(xì)胞活性(%)。C)培養(yǎng)3天的載有 NSC 的生物3D打印水凝膠中的細(xì)胞骨架染色圖像。D)培養(yǎng)7天染色的 DAPI (藍(lán)色) ，Tuj-1(綠色)和 GFAP (紅色)的生物3D打印的含NSCs水凝膠圖像。E-f)(d)中白色框選區(qū)的放大圖像。G)培養(yǎng)14天的生物3D打印 NSC水凝膠內(nèi)神經(jīng)元的鈣成像。相對(duì)神經(jīng)活動(dòng)顯示為顏色編碼，信號(hào)強(qiáng)度范圍從黑色(非活躍)到白色(高活躍)。加入谷氨酸后測量和記錄H)陽性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化。

體內(nèi)免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)

將大鼠隨機(jī)分為3組，將不含細(xì)胞3D水凝膠(支架組，S組)或載NSC-3D生物支架(載NSC支架組，SN組)植入病變部位填充空腔，以不植入任何內(nèi)固定物的未處理脊髓損傷組作為對(duì)照組(SCI組)。脊髓損傷可能引起一系列炎癥事件，并在損傷后7天達(dá)到高峰。在這種情況下，炎癥微環(huán)境對(duì)于移植的神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)的存活及其長期的神經(jīng)修復(fù)作用具有至關(guān)重要的意義。小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞是脊髓損傷后炎癥過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)細(xì)胞。因此，研究進(jìn)行了 CD68免疫熒光染色來表征總巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，并與 CD206共標(biāo)記，以定位 M2極化的巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞。巨噬細(xì)胞表型從促炎 M1向抗炎 M2的轉(zhuǎn)變?cè)谥笇?dǎo)組織修復(fù)中尤為重要。然而，這種轉(zhuǎn)變?cè)诩顾钃p傷中通常是停滯不前的。在該研究中，研究發(fā)現(xiàn) S 組相比于比SCI組而言活性巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著減少，M2巨噬細(xì)胞比例顯著增加，表明植入 ECM 樣支架有利于炎癥調(diào)節(jié)功能。這些結(jié)果可以通過植入的支架的機(jī)械性能，具有適當(dāng)孔隙率和仿生ECM組分可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的浸潤和極化來解釋。與 S 組相比，SN 組活化的巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著減少，M2巨噬細(xì)胞百分比顯著提高，表明活神經(jīng)樣纖維內(nèi)的 NSCs 也顯示出顯著的抗炎功能，這可能是由炎性細(xì)胞因子和 NSCs 分泌的細(xì)胞因子之間的復(fù)雜相互作用引起。此外，先前的研究表明，核酸藥物重編程的雪旺細(xì)胞可以通過增強(qiáng)的細(xì)胞間通訊促進(jìn)巨噬細(xì)胞進(jìn)入 M2表型，這證明了細(xì)胞間通信（cell-cell crosstalk）在調(diào)節(jié)免疫信號(hào)傳導(dǎo)中的重要性。ECM 樣水凝膠和負(fù)載的 NSCs 協(xié)同作用，導(dǎo)致?lián)p傷后免疫微環(huán)境中細(xì)胞-細(xì)胞通訊和細(xì)胞-生物材料相互作用的增強(qiáng)，這可以有效地指導(dǎo)募集的巨噬細(xì)胞進(jìn)入 M2表型并減輕局部炎癥反應(yīng)。總的來說，活體神經(jīng)樣纖維通過水凝膠和 NSCs 對(duì)炎癥微環(huán)境的協(xié)同反應(yīng)呈現(xiàn)出突出的免疫調(diào)節(jié)功能，有助于加速從促炎癥到抗炎的炎癥狀態(tài)，并將受損組織推向修復(fù)和再生。星形膠質(zhì)細(xì)胞現(xiàn)在被認(rèn)為是脊髓損傷后重塑的參與者，它可以被激活并對(duì)炎癥環(huán)境作出反應(yīng)。為了研究活體神經(jīng)樣纖維在急性炎癥階段如何調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞，研究分別用膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和 Iba-1標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞。值得注意的是，在 SCI 組中，大量活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞已經(jīng)遷移到病變部位并形成致密的壁狀構(gòu)造，并且創(chuàng)建了隔離相鄰宿主脊髓和病變核心的柵欄樣邊界。這種由強(qiáng)烈激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞形成的壁狀結(jié)構(gòu)可能構(gòu)成軸突生長的物理和化學(xué)屏障。相反，在 S 和 SN 組中，在病變邊緣發(fā)現(xiàn)松散排列的星形膠質(zhì)細(xì)胞以橋式模式連接宿主脊髓和植入物，表明星形膠質(zhì)細(xì)胞由于抑制巨噬細(xì)胞活化處于幼稚狀態(tài)而不是瘢痕形成狀態(tài)。此外，這種橋狀星形膠質(zhì)細(xì)胞可以作為一個(gè)支持的備用軸突，有助于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建。

圖4. 活體神經(jīng)樣纖維調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。A-B)損傷后1周，三組受傷脊髓的前段、病變段和尾段的CD68(綠色)、 CD206(紅色)和 DAPI (藍(lán)色)免疫熒光染色圖像。C-D)定量檢測 CD68陽性細(xì)胞密度、 M2巨噬細(xì)胞極化率。E)三組損傷部位的 DAPI (藍(lán)色) ，GFAP (白色) ，Iba1(紅色)的免疫組織化學(xué)染色的圖像。虛線標(biāo)記了病變部位和宿主脊髓之間的邊界。黃色五角星表示損傷部位。

重建新生神經(jīng)元的生態(tài)微環(huán)境

由反應(yīng)性膠質(zhì)瘢痕分泌的硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPGs)已被證明是軸突重塑的主要抑制劑，導(dǎo)致脊髓損傷后神經(jīng)再生失敗。研究進(jìn)一步分析了CSPG對(duì)不同組中軸突生長錐的抑制作用，在損傷后12周，通過染色 CS-56來標(biāo)記CSPG，并染色GAP43來標(biāo)記軸突生長錐。在脊髓損傷組，大量CSPG沉積在損傷部位形成密集的化學(xué)屏障，阻礙宿主神經(jīng)跨界生長進(jìn)入損傷部位。此外，放大的圖像表明，再生軸突停止在 CSPG 豐富的區(qū)域。這是因?yàn)檩S突生長錐對(duì)微環(huán)境的特征高度敏感。一旦他們到達(dá)病變核心含有豐富的CSPG，他們停止生長和由于營養(yǎng)不良收縮成球。由于ECM樣水凝膠的免疫調(diào)節(jié)作用，S組CS-56陽性面積明顯減少，并且在損傷邊界上觀察到一些出芽的軸突。值得注意的是，SN組中CS-56陽性區(qū)域很少，而是以相對(duì)對(duì)齊的模式被高密度的 GAP43陽性軸突取代，這表明在病變部位正在進(jìn)行較好的神經(jīng)軸突再生。

由于新生神經(jīng)元經(jīng)歷增殖，軸突延伸和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成，需要同步血管化來滿足神經(jīng)組織再生過程中營養(yǎng)物質(zhì)和代謝交換的需求。因此，為損傷部位創(chuàng)造一個(gè)再生的神經(jīng)血管生態(tài)微環(huán)境對(duì)于新生神經(jīng)元功能化和組織再生至關(guān)重要。為了進(jìn)一步了解活體神經(jīng)樣纖維的協(xié)同再生作用，通過在損傷后12周對(duì) Tuj-1和大鼠內(nèi)皮細(xì)胞抗原-1(RECA-1)進(jìn)行免疫染色來觀察新生神經(jīng)元和血管。在 S 組和 SN 組的病變部位可以觀察到更均勻分布的 RECA-1和 Tuj-1陽性細(xì)胞，表明新生神經(jīng)元受到營養(yǎng)結(jié)構(gòu)的支持。值得注意的是，SN 組的共焦 z 疊加圖像顯示有一些新生血管具有管腔樣結(jié)構(gòu)，在病變部位的新生神經(jīng)元周圍均勻再生，這為新生神經(jīng)元向功能化方向發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。結(jié)果表明，活體神經(jīng)樣纖維通過減少抑制性化學(xué)屏障的產(chǎn)生和重建血管系統(tǒng)，優(yōu)化了新生神經(jīng)元的生態(tài)位，有助于維持其可持續(xù)的功能。

圖5. 活體神經(jīng)樣纖維為新生神經(jīng)元?jiǎng)?chuàng)造了一個(gè)合適的生態(tài)微環(huán)境。A)在傷后12周，在三組中代表性的低和高放大率免疫熒光圖像的 DAPI (藍(lán)色) ，GAP43(紅色)和 CS-56(綠色)。B)損傷后12周，三組受損脊髓的前段、病變段和尾段的DAPI (藍(lán)色) ，Tuj-1(紅色)和 RECA-1(綠色) 代表性免疫熒光圖像，黃色五角星表示損傷部位。虛線標(biāo)記了病變部位和宿主脊髓之間的邊界。C-d) SN 組病變部位的高倍 Z- 疊加圖像; 箭頭，具有管腔樣的血管結(jié)構(gòu)。

神經(jīng)再生和髓鞘再生

對(duì)于打算脊髓損傷修復(fù)，損傷核心神經(jīng)元的補(bǔ)充是神經(jīng)回路重建的基礎(chǔ)。為了鑒定和評(píng)估不同處理的完整橫斷脊髓的神經(jīng)元再生能力，研究對(duì)神經(jīng)元 III 類 β-微管蛋白(Tuj-1)進(jìn)行免疫染色以顯現(xiàn)新生神經(jīng)元，生長相關(guān)蛋白-43(GAP43)以顯現(xiàn)再生出芽軸突和神經(jīng)絲200(NF)以檢測成熟的神經(jīng)纖維。SN組損傷部位有豐富的再生 Tuj-1陽性細(xì)胞，與 S組(P<0.01)和SCI組(P<0.001)相比顯著增加。同時(shí)，S組由于ECM 樣水凝膠的免疫調(diào)節(jié)作用，減少了瘢痕組織的形成，從而使多余的神經(jīng)元遷移到損傷部位。而活體神經(jīng)樣纖維不僅為存活體神經(jīng)元建立了良好的生態(tài)位，而且從原位神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)發(fā)生中補(bǔ)充了大量的神經(jīng)元。軸突的生長方向是高度敏感的，并且通過整合外部線索使其終端樹枝狀朝向正確的目標(biāo)。 SCI和S組相比，SN組中的GAP43陽性軸突以相對(duì)均勻和定向的模式排列，這可能是由于在印刷纖維中均勻分布的 NSCs 的高密度可以作為指導(dǎo)神經(jīng)元通過直接接觸或旁分泌手段延伸的方向。GAP43陽性軸突的定量分析表明，與SCI(P<0.001)和S組(P<0.001)相比，SN組具有最高的出芽軸突密度，這表明3D 打印的活神經(jīng)樣纖維提供的再生軸突的理想生態(tài)位(圖6b8)。最重要的是，與SCI和S組相比，豐富的神經(jīng)纖維不僅在病變邊緣而且在病變核心處再生，并且在 SN組中連續(xù)分布(圖6a9) ，表明活體神經(jīng)樣纖維的均勻，快速和強(qiáng)大的神經(jīng)再生能力。這些結(jié)果表明，ECM樣水凝膠和充足的神經(jīng)干細(xì)胞組裝的活體神經(jīng)樣纖維3D 為更好的神經(jīng)再生提供了一個(gè)優(yōu)越的平臺(tái)。

圖6.活體神經(jīng)樣纖維增強(qiáng)神經(jīng)再生。A1-A3)損傷后12周，三組脊髓縱向切片的代表性免疫熒光圖像，DAPI (藍(lán)色)與 Tuj-1(紅色)共同染色。B1-B3)分別來自 A1、 A2、 A3的放大圖像。A4-a6)損傷后12周，三組脊髓縱向切片的代表性免疫熒光圖像，DAPI (藍(lán)色)與 GAP43(紅色)共同染色。B5-B7)放大圖像分別來自 A4，A5，A6，傷后12周。A7-A9)損傷后12周，三組脊髓縱向切片的代表性免疫熒光圖像，DAPI (藍(lán)色)與 NF (紅色)共同染色。B9-A11)分別來自 A7、 A8和 A9的放大圖像。B4) Tuj1陽性軸突密度的定量分析，B8) GAP43陽性軸突密度和 B12) NF 陽性軸突密度(陽性免疫反應(yīng)面積/總面積) ; n=5。

髓鞘包裹軸突，使軸突電絕緣，提高神經(jīng)傳導(dǎo)的速度和準(zhǔn)確性，同時(shí)為軸突提供營養(yǎng)支持和保護(hù)，所以髓鞘再生在重建神經(jīng)元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用。在損傷后12周，通過甲苯胺藍(lán)染色和透射電子顯微鏡(TEM)分別檢查所有組中神經(jīng)損傷部位的半薄和超薄切片。在SN組中，大部分再生神經(jīng)纖維被髓鞘包裹。相比之下，S組的神經(jīng)纖維顯示出大量的再生軸突，而髓鞘小而薄。此外，在脊髓損傷組，很少有再生軸突和髓鞘。定量分析顯示，SN組有髓神經(jīng)纖維密度(20225±2747神經(jīng)/mm²)顯著高于 S組(9092±3228神經(jīng)/mm²，P <0.001)和 SCI組(2918±656神經(jīng)/mm²，P<0.001)(圖7c)。為了進(jìn)一步評(píng)估再髓鞘形成的程度，使用 TEM 通過超微結(jié)構(gòu)分析計(jì)算基于面積的 G 比率(軸突面積/整個(gè)有髓軸突面積) ，并通過箱形圖(圖7d)和散點(diǎn)圖(圖7e)呈現(xiàn)。SN 組面積比(0.42±0.06)顯著低于S組(0.53±0.04，P<0.001)和 SCI組(0.61±0.44，P<0.001) ，表明髓鞘再生相對(duì)成熟。此外，與 S組和 SCI組相比，SN 組的再生神經(jīng)纖維顯示更大的有髓神經(jīng)纖維，反映了活神經(jīng)纖維的持續(xù)促髓鞘形成能力。然后，研究分別使用髓鞘基礎(chǔ)蛋白(MBP，表示髓鞘)和 NF (表示神經(jīng)纖維)在病變部位通過 IF染色縱向和橫向切片觀察軸突的髓鞘形成。在 SN 組中，縱切片的Z疊加共定位圖像顯示再生的神經(jīng)纖維包裹著密集和有組織的髓磷脂，并且 z切片顯示由髓磷脂環(huán)繞神經(jīng)纖維組成的典型的“殼核”結(jié)構(gòu)。相比之下，這種結(jié)構(gòu)在 S 組中不太普遍，在 SCI 組中偶爾出現(xiàn)。這些結(jié)果提示支架移植能促進(jìn)軸突再生，但再生軸突不足，髓鞘重建不足。同時(shí)，活體神經(jīng)樣纖維移植到損傷部位可顯著促進(jìn)軸突再生和髓鞘再生。

圖7.活體神經(jīng)樣纖維促進(jìn)髓鞘再生。A-B)分別在 SCI，S 和 SN 組的病變部位的橫切片的甲苯胺藍(lán)染色和 TEM 圖像。C)來自甲苯胺藍(lán)染色圖像(數(shù)量/總面積)的有髓神經(jīng)纖維密度的定量分析。D)透射電鏡圖像中基于面積的 G 比值的定量分析。E)來自 TEM 圖像的G比與神經(jīng)纖維面積的散點(diǎn)圖; F) SN 組脊髓縱向和橫向切片的代表性免疫熒光圖像，共同染色 NF (綠色)和 MBP (紅色)。G) SN組縱向切片病變部位的高倍 Z- 疊加圖像。

神經(jīng)中繼形成和功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)

外源性 NSCs 衍生的神經(jīng)元可以通過形成突觸連接作為宿主脊髓和病變部位之間的“信號(hào)中繼站”，這被認(rèn)為是嚴(yán)重 SCI 修復(fù)的有希望和有效的策略。損傷后12周，研究用 NF 和 SYN (突觸前標(biāo)記物突觸素 I)標(biāo)記受損脊髓的縱向冷凍切片，從而可視化再生神經(jīng)纖維之間的突觸形成。此外，在SN組中，GFP被用來區(qū)分移植細(xì)胞和宿主細(xì)胞。IF染色結(jié)果顯示，移植到損傷部位的活體神經(jīng)樣纖維在整個(gè)損傷部位實(shí)現(xiàn)了廣泛和強(qiáng)大的神經(jīng)纖維再生。同時(shí)，在SN組病變核心有許多有序的 GFP/NF 共陽性(指移植來源的神經(jīng)元)和一些 NF 陽性神經(jīng)纖維(指宿主神經(jīng)元)。這些纖維密切接觸，并已檢測到高密度SYN信號(hào)，表明新生突觸來源于移植物和宿主神經(jīng)元。透射電鏡顯示SN組再生突觸的超微結(jié)構(gòu)。此外，新生軸突中形成的再生突觸百分比的定量分析顯示 N (3.40±1.36%)和SN(10.79±3.62%)組之間有顯著差異(P<0.001)， SN組中的再生神經(jīng)元具有改善的連接性。總的來說，這些結(jié)果表明，活體神經(jīng)樣纖維可以在病變部位建立外源性神經(jīng)元中繼，并與宿主神經(jīng)元整合，有助于傳遞來自脊髓上下行通路的信號(hào)。

為了探索新生神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的功能，研究通過染色膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(chAT) ，酪氨酸羥化酶(TH)和血清素(5-HT)分別鑒定了膽堿能，多巴胺能和5-羥色胺能軸突的再生。在SN組，結(jié)果顯示在病變部位有大量可見的NF和ChAT雙染色的軸突，并且大部分共表達(dá)GFP。同樣，病變部位連續(xù)和豐富的 NF 陽性軸突顯示TH和GFP陽性信號(hào)。此外，Z疊層圖像顯示，與移植物分化的5-HT陽性軸突在病變核心表現(xiàn)出大約260μm 的延伸。相比之下，其他組在損傷部位很少觀察到功能性神經(jīng)元的染色。上述結(jié)果表明，活體神經(jīng)樣纖維內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞可分化為與運(yùn)動(dòng)和感覺有關(guān)的功能性神經(jīng)元。此外，在 SN組的病變部位也觀察到一些非 GFP表達(dá)的功能性神經(jīng)元(即宿主細(xì)胞) ，這可能是由于移植的活神經(jīng)樣纖維提供的微環(huán)境改善，導(dǎo)致一些內(nèi)源性功能性神經(jīng)元的募集。

圖8. 這些活體神經(jīng)樣纖維重塑了一個(gè)功能性的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。A) SN 組脊髓縱向切片的代表性免疫熒光圖像與 GFP (綠色) ，NF (紅色) ，SYN (白色)共染色; A2-A5)來自(A1)的放大圖像; A6)染色 GFP (綠色) ，NF (紅色) ，SN 組的 SYN (白色)。B) TEM 圖像檢測 SN 組的突觸形成; 黃色箭頭表示經(jīng)典的突觸結(jié)構(gòu); 黃色虛線矩形標(biāo)記插入，顯示突觸結(jié)構(gòu)的放大圖像。C) NF 陽性細(xì)胞內(nèi)突觸形成比率的定量分析。n = 5.D1-d3)在 SN 組病變部位的 DAPI (藍(lán)色) ，GFP (綠色) ，NF (紅色)和 ChAT (白色)免疫標(biāo)記的代表性圖像。D4-D6)在 SN 組病變部位的 DAPI (藍(lán)色) ，GFP (綠色) ，NF (紅色)和 TH (白色)免疫標(biāo)記的代表性圖像，D7)在 SN 組病變部位的 DAPI (藍(lán)色) ，GFP (綠色) ，NF (紅色)和5-HT (白色)免疫標(biāo)記的代表性圖像。E) SN 組 BDA 免疫染色矢狀切片概述。E2-E4)分別在(E1)中放大了前段、病變段和尾段的圖像。虛線標(biāo)記了病變部位和宿主脊髓之間的邊界。

功能恢復(fù)和安全評(píng)估

在 SCI 后，研究每周使用 Basso，Beattie 和 Bresnahan (BBB)評(píng)分來評(píng)估不同組大鼠的運(yùn)動(dòng)恢復(fù)情況(圖9a)。與對(duì)照組(N組和SCI組)相比，SN組大鼠表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)恢復(fù)。此外，對(duì)于 SN組，手術(shù)后(0周)大鼠已經(jīng)從完全癱瘓恢復(fù)，平均在傷后12周時(shí)偶爾承重背部踏步(中位BBB評(píng)分=9)。研究使用Catwalk 分析(圖9b)和傾斜網(wǎng)格試驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估了傷后12周自主和協(xié)調(diào)的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。SCI組大鼠的足跡顯示出線狀模式，表明后肢持續(xù)拖動(dòng)(圖9b) ，與網(wǎng)格測試結(jié)果一致，共同表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)功能的負(fù)恢復(fù)。然而，S組大鼠可以間歇性地將后肢抬離地面(圖9b) ，并且在網(wǎng)格上爬行時(shí)呈現(xiàn)后肢適度的自主運(yùn)動(dòng)，而很少承重。值得注意的是，相比之下，SN組大鼠在 Catwalk 分析中表現(xiàn)出更明顯的間歇性足跡(圖9b) ，同時(shí)在爬坡過程中出現(xiàn)頻繁的足底踏步和偶爾的前肢-后肢協(xié)調(diào)(圖9c，視頻 S3)。此外，在三個(gè)不同組的大鼠中進(jìn)行經(jīng)顱電生理測試以激發(fā)MEP，MEP是運(yùn)動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)能力的可靠指標(biāo)(圖9d)。結(jié)果顯示，按照SCI，S和 SN組大鼠的順序，MEP幅度顯著增加，而 MEP 潛伏期縮短(圖9e-f) ，表明在 SN 組中，損傷部位的再生神經(jīng)中繼有效地促進(jìn)了電信號(hào)的傳導(dǎo)�？偟膩碚f，這些結(jié)果提供了活體神經(jīng)樣纖維移植能夠使脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的證據(jù)。

泌尿系統(tǒng)功能障礙是 SCI 常見但嚴(yán)重的并發(fā)癥，并導(dǎo)致危及生命的后果。為了進(jìn)一步研究不同治療方法脊髓損傷后泌尿系統(tǒng)的變化，研究檢查了大鼠膀胱和腎臟的病理學(xué)特征三組，傷后12周。結(jié)果表明，活體神經(jīng)樣纖維移植可以防止脊髓損傷大鼠膀胱粘膜水腫和肌束紊亂的病理損傷，這是由于其不僅在局部脊髓而且在全身具有顯著的抗炎作用。腎組織的研究反映了類似的結(jié)果。這些研究結(jié)果表明，脊髓損傷大鼠活神經(jīng)樣纖維治療，同時(shí)促進(jìn)神經(jīng)再生，也保護(hù)大鼠免受嚴(yán)重的泌尿系統(tǒng)并發(fā)癥。

圖9.活體神經(jīng)樣纖維促進(jìn)功能恢復(fù)。A)運(yùn)動(dòng)-傷后每周后肢 BBB 評(píng)分。雙向重復(fù)測量方差分析(方差分析)。* P < 0.05，* * P < 0.01，* * * P < 0.001; n = 8.B)貓步系統(tǒng)記錄的有代表性的足跡。C)大鼠從底部向上爬時(shí)后肢的時(shí)間序列圖像; 向上箭頭表示時(shí)間序列的方向。D)代表性記錄的皮層運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(MEP)。E-f) MEP 幅度和潛伏期的定量分析; * P < 0.05，* * P < 0.01，* * * P < 0.001; n = 3。G)膀胱組織的H&E染色和 Mason 染色圖像。

結(jié)論和展望

總的來說，生物3D打印的活體神經(jīng)樣纖維最大限度地發(fā)揮了神經(jīng)干細(xì)胞在脊髓損傷修復(fù)中的治療潛力。研究的研究結(jié)果提供證據(jù)表明，ECM樣水凝膠保護(hù)外源性神經(jīng)干細(xì)胞免受嚴(yán)酷的炎癥環(huán)境，并為神經(jīng)干細(xì)胞的長期存活，神經(jīng)譜系分化和功能性突觸形成提供了有利的生態(tài)微環(huán)境。此外，類 ECM水凝膠能夠通過支持和粘附作用原位定位外源性神經(jīng)干細(xì)胞，同時(shí)通過損傷部位的結(jié)構(gòu)線索引導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)元遷移。通過這種方式，宿主脊髓識(shí)別，接納并整合外源性 NSCs衍生的再生神經(jīng)回路，這表明3D打印的活體構(gòu)建體可以在體內(nèi)成熟為真正的活組織，實(shí)現(xiàn)了丟失組織的替換。由于三維生物打印活體神經(jīng)樣纖維的仿生結(jié)構(gòu)和組成部分，ECM樣水凝膠與攜帶的外源性神經(jīng)干細(xì)胞協(xié)同作用，發(fā)揮出突出的生態(tài)微環(huán)境重建功能，協(xié)調(diào)有效的免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)發(fā)生、血管形成、髓鞘再生、神經(jīng)中繼形成和神經(jīng)回路重塑，共同促進(jìn)了大段脊髓損傷修復(fù)和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。

參考文獻(xiàn)

Yang J, Yang K, Man W, et al. 3D bio-printed living nerve-like fibers refine the ecological niche for long-distance spinal cord injury regeneration[J]. Bioactive Materials, 2023, 25: 160-175.

https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2023.01.023.