《Adv Sci》：軟骨內(nèi)成骨雙重調(diào)節(jié)的三維生物打印各向異性支架重建肱骨頭

來(lái)源： EngineeringForLife

組織工程學(xué)在理論上被認(rèn)為是一種很有前途的重建生物關(guān)節(jié)的方法，因此為晚期骨關(guān)節(jié)炎的治療提供了一種潛在的選擇。然而，到目前為止，在大型生物關(guān)節(jié)的再生方面還沒有取得重大進(jìn)展。

最近，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院骨科朱俊峰在《Advanced Science》上發(fā)表了題為Regeneration of Humeral Head Using a 3D Bioprinted Anisotropic Scaffold with Dual Modulation of Endochondral Ossification的文章。研究者利用三維打印技術(shù)，設(shè)計(jì)并一步制作了一種兔子肱骨頭再生仿生支架，促進(jìn)了軟骨下骨再生。

研究者首先使用激光獲取了兔近端肱骨關(guān)節(jié)的形態(tài)，并設(shè)計(jì)了一種解剖學(xué)上正確的仿生支架，然后利用多噴嘴3D打印系統(tǒng)，制備了具有不同生化線索和不同結(jié)構(gòu)的滑膜關(guān)節(jié)支架，如圖1所示。

圖1 基于CAD/CAM技術(shù)構(gòu)建了不同結(jié)構(gòu)和組成的兔肱骨頭支架

隨后，研究者進(jìn)行了生物相容性研究，培養(yǎng)1、3、5、7d后，BMSCs均勻分布于支架內(nèi)(圖2A)。各組間細(xì)胞存活率都很高(超過(guò)95%)，統(tǒng)計(jì)分析表明不同組之間沒有顯著差異(圖2B)。此外，細(xì)胞增殖能力隨培養(yǎng)時(shí)間增加而增強(qiáng)。這些結(jié)果表明所制備的生物支架具有良好的生物相容性，可用于細(xì)胞的長(zhǎng)期生長(zhǎng)。

圖2 激光共聚焦掃描檢測(cè)支架的生物相容性

研究者結(jié)合不同的生化線索(甲狀旁腺激素[PTH]和化學(xué)成分羥基磷灰石[HA]分別位于內(nèi)外區(qū)域)用于軟骨內(nèi)成骨的雙重調(diào)節(jié)。外區(qū)動(dòng)態(tài)機(jī)械刺激聯(lián)合生長(zhǎng)因子PTH抑制軟骨內(nèi)成骨，促進(jìn)軟骨再生；內(nèi)區(qū)動(dòng)態(tài)機(jī)械刺激聯(lián)合HA促進(jìn)軟骨內(nèi)成骨，促進(jìn)軟骨下骨再生。

經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)，動(dòng)態(tài)加壓和生化刺激組的相關(guān)基因表達(dá)最高(圖3B-D)，且生物力學(xué)刺激的基因促進(jìn)效果要高于生化刺激組。

結(jié)果表明，動(dòng)態(tài)機(jī)械加壓復(fù)合PTH雙刺激支架能更好地誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化，抑制軟骨內(nèi)成骨，而動(dòng)態(tài)機(jī)械加壓復(fù)合羥基磷灰石(HA)則刺激軟骨內(nèi)成骨過(guò)程，有利于BMSCs的體外成骨。

圖3 模擬柱狀支架上軟骨層和下軟骨下骨層軟骨內(nèi)成骨相關(guān)基因的表達(dá)

為了從蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步評(píng)價(jià)生物3D打印支架對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨內(nèi)成骨過(guò)程的調(diào)控作用，研究者在體外培養(yǎng)30d后對(duì)不同支架的外層和內(nèi)層進(jìn)行了Col-II和Col-X的免疫熒光染色。如圖四所示，雙刺激組顯著高于單刺激組高于無(wú)刺激組，與基因檢測(cè)結(jié)果一致，表明在甲狀旁腺素動(dòng)態(tài)加壓的協(xié)同作用下，抑制了BMSCs的軟骨內(nèi)成骨和成軟骨能力，而在生物力學(xué)刺激和HA誘導(dǎo)的聯(lián)合作用下，顯著促進(jìn)了軟骨內(nèi)成骨的發(fā)展。

圖4 體外刺激后Col-II和Col-X的免疫熒光分析

進(jìn)一步平均不同刺激物對(duì)軟骨再生的促進(jìn)作用，組織學(xué)分析顯示，非刺激組表面僅見少量散在的軟骨組織。相反，染色顯示支架表面生成的軟骨組織的厚度和覆蓋率逐漸增加(圖5)。

在生化、生物力學(xué)和雙重刺激組中。雙刺激組表層再生較厚、連續(xù)的軟骨，有較好的ECM沉積，SO/FG染色顯示軟骨基質(zhì)增多，HE和Masson染色顯示細(xì)胞填充良好。相比之下，生化組和生物力學(xué)刺激組的軟骨較薄。

圖5 各組體外刺激后肱骨頭硬組織切片的組織學(xué)觀察

接下來(lái)研究者對(duì)肩關(guān)節(jié)進(jìn)行X光和MRI掃描，以評(píng)估植入的肱骨頭修復(fù)的固定和再生組織的形成(圖6)。從新生骨密度、再生肱骨形狀、是否脫位等方面，雙刺激組最好，單刺激組次之，均優(yōu)于無(wú)刺激組。

圖6 植入支架后4個(gè)月拍攝肩關(guān)節(jié)X線片和MRI照片

最后研究者對(duì)體內(nèi)再生肱骨頭的炎癥、組織學(xué)和力學(xué)評(píng)價(jià)，得到了雙刺激組炎癥下降最明顯的結(jié)論。并在4個(gè)月后對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂死，并收集標(biāo)本進(jìn)行大體觀察。結(jié)果顯示，在無(wú)刺激組中，殘留的肱骨頭支架中新形成的組織大部分為纖維化組織，幾乎沒有軟骨和骨再生。且從視覺組織學(xué)評(píng)估量表、機(jī)制密度、軟骨體積等方面，雙刺激組結(jié)果均最好(圖7)。

再軟骨下區(qū)域，再生骨量在雙刺激組中最高，其次是生物力學(xué)組、生化組（圖 8A）,并且沒有刺激組。骨體積/總體積比(BV/TV)、骨表面/骨體積比(BS/BV)和成骨細(xì)胞數(shù)量的定量分析進(jìn)一步驗(yàn)證了這一趨勢(shì)（圖8B-D）。

這些結(jié)果表明，生物力學(xué)刺激促進(jìn)了再生軟骨組織的軟骨內(nèi)骨化過(guò)程，加速了成熟骨組織的形成。

圖7 體內(nèi)半肩關(guān)節(jié)置換術(shù)后肱骨頭軟骨再生的組織學(xué)檢查

圖8 體內(nèi)半肩關(guān)節(jié)置換后肱骨頭軟骨下骨再生的組織學(xué)檢查

綜上，研究者展示了一種3D生物打印支架，具有各向異性結(jié)構(gòu)和類似于天然肱骨頭的異質(zhì)成分。通過(guò)動(dòng)態(tài)壓縮和調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)骨化的生化線索的雙重刺激，實(shí)現(xiàn)了透明軟骨和軟骨下骨的各向異性再生。這種方法還為設(shè)計(jì)和制造具有臨床相關(guān)尺寸的解剖學(xué)上匹配的大型植入物提供了替代方案。

文章來(lái)源：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202205059