《Biofabrication》：3D打印助力“魚鱗明膠”新應(yīng)用可用作骨修復(fù)

來源：EngineeringForLife  

開發(fā)適用于生物制造和模擬細(xì)胞外基質(zhì)物理化學(xué)特性的生物材料墨水對于組織工程應(yīng)用中的生物打印技術(shù)至關(guān)重要。使用動物來源的蛋白質(zhì)材料，如水母膠原蛋白或魚鱗(FS)明膠，已成為生物材料墨水設(shè)計的重要支柱，以提高水凝膠的生物活性。然而，除了提取蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)外，由于其有機(jī)（膠原蛋白）和無機(jī)（羥基磷灰石）含量，使用結(jié)構(gòu)完整的FS作為添加劑可以提高水凝膠的生物相容性和生物活性，同時提高3D打印應(yīng)用中的機(jī)械強(qiáng)度。

為了檢驗這一假設(shè)，來自伊利諾伊理工學(xué)院的Funda Tihminlioglu聯(lián)合埃爾朗根-紐倫堡大學(xué)的Aldo R Boccaccini團(tuán)隊展示了一種由FS和藻酸鹽二醛明膠(ADA-GEL)組成的復(fù)合生物材料墨水，用于3D生物打印應(yīng)用（圖1）。由于水凝膠顯著增加的剛度和支持的骨誘導(dǎo)性，作為天然膠原蛋白和羥基磷灰石來源的FS結(jié)構(gòu)有助于骨工程應(yīng)用的生物材料墨水特性。FS微粒是膠原蛋白和羥基磷灰石的天然來源（圖 1B），用作生物相容性添加劑，ADA-GEL 用作水凝膠基質(zhì)（圖1C）。

相關(guān)研究成果以“Fish scale containing alginate dialdehyde-gelatin bioink for bone tissue engineering”為題于2023年1月27日發(fā)表在《Biofabrication》上。

圖1 含有前成骨細(xì)胞 MC3T3-E1 細(xì)胞的 ADA-GEL/FS 生物墨水示意圖

1. 3D打印的ADA-GEL/FS水凝膠
含有1%、3%、5% 和 10%（重量百分比）FS 顆粒的 3D 生物打印 ADA-GEL/FS 水凝膠很容易制成具有10層的圓形。圖2A-C顯示了分別使用氯化鈣和mTG交聯(lián)后細(xì)絲形成、印刷ADA-GEL/FS結(jié)構(gòu)和印刷水凝膠結(jié)構(gòu)的優(yōu)化。印刷結(jié)構(gòu)的光學(xué)顯微鏡圖像表明所有組都具有形狀保真度和鏈之間的方形大孔。ADA-GEL/FS的可打印性根據(jù) Pr 因子、U 因子、孔徑和線直徑進(jìn)行評估。（圖2D-F）。此外，制造的支架的孔徑隨著 FS 濃度的增加而減小（圖2G）。

圖2 3D打印水凝膠復(fù)合支架

SEM顯示在ADA-GEL基質(zhì)中摻入FS顆粒會增加表面的粗糙度（圖3A）。通過增加顆粒濃度和摻入 ADAGEL 結(jié)構(gòu)來改變支架的表面形態(tài)FS 顆粒的膠原含量及其纖維結(jié)構(gòu)會影響表面形態(tài)，從而導(dǎo)致表面粗糙度增加。顆粒與 ADA-GEL 相互作用的區(qū)域和結(jié)構(gòu)中顆粒的纖維結(jié)構(gòu)如圖3B所示。明膠和膠原蛋白的相同化學(xué)成分使 ADA-GEL 和 FS 顆粒之間具有良好的相互作用，并具有適當(dāng)?shù)慕缑嫦嗷プ饔谩?br />

圖3 3D打印FS增強(qiáng)型ADA-GEL支架

2. FS顆粒的添加提高了機(jī)械性能
通過應(yīng)力松弛試驗研究了摻入FS的ADA-GEL水凝膠的機(jī)械性能。為機(jī)械測試準(zhǔn)備的水凝膠的光學(xué)顯微鏡圖像如圖4A所示，測試結(jié)果表明ADA-GEL的剛度和楊氏模量最低，松弛速度最快。將FS摻入ADA-GEL基質(zhì)中可顯著提高剛度，從而提供復(fù)合結(jié)構(gòu)，SEM圖像證實了這一點（圖4B）。與其他組相比，在 10%FS摻入組中發(fā)現(xiàn)更高的壓應(yīng)力。隨著顆粒濃度的增加，水凝膠的應(yīng)力松弛得到顯著改善。水凝膠的楊氏模量根據(jù)顆粒濃度而增加，在ADAGEL/10%水凝膠中，較高的模量記錄為 96±8kPa，與其他組相比存在統(tǒng)計學(xué)差異（圖4D）。

圖4 復(fù)合水凝膠的機(jī)械性能

3. ADA-GEL/FS組合物增加生物活性
ADA-GEL/FS 支架的生物活性通過SEM、EDX和FTIR分析進(jìn)行評估。通過在SBF中形成礦化CaP涂層的沉積。EDX分析證實了支架表面的CaP層形成，顯示了形成層表面的鈣 (Ca)、氧 (O) 和磷 (P) 元素（圖6B）；FTIR光譜表明復(fù)合支架表面形成了碳酸鹽和磷酸鹽。結(jié)合 SEM、EDX 和 FTIR 結(jié)果，可以證實ADA-GEL/FS 水凝膠具有生物活性，生物活性隨著 FS 顆粒的添加增加了CaP的形成。

圖5 ADA-GEL/FS復(fù)合支架的生物活性研究

4. 水凝膠的細(xì)胞培養(yǎng)
接著，作者進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)研究以研究MC3T3-E1前成骨細(xì)胞在生物制造的ADA-GEL/FS復(fù)合水凝膠中的活力、形態(tài)、增殖和生物活性。通過活/死染色測定法評估細(xì)胞的活力，染色結(jié)果表明細(xì)胞在14天后在摻入FS的生物墨水組合物中存活并保持其活力（圖7A）。活細(xì)胞（綠色）擴(kuò)散并覆蓋水凝膠表面，在細(xì)胞培養(yǎng)期間甚至培養(yǎng)后期觀察到少量死細(xì)胞（紅色）。此外，細(xì)胞活力被確定為超過 90%（圖7），這表明生物墨水組合物具有生物相容性適合細(xì)胞生長。此外，細(xì)胞培養(yǎng)表明MC3T3-E1前成骨細(xì)胞在14天的培養(yǎng)中保持活力，沒有任何細(xì)胞毒性作用（圖7C-D）。

圖6 純ADA-GEL和FS摻入ADA-GEL細(xì)胞水凝膠的細(xì)胞毒性評估

5. ADA-GEL/FS水凝膠誘導(dǎo)成骨分化
通過光學(xué)顯微鏡（圖7A）和活/死染色（圖7B）觀察到FS顆粒上的細(xì)長和擴(kuò)散細(xì)胞顯示出細(xì)胞-顆粒相互作用 MC3T3-E1 細(xì)胞在聚合物基質(zhì)內(nèi)部和 FS 表面附著并增殖。由于 ADA-GEL/FS 水凝膠有利的微環(huán)境，細(xì)胞會在細(xì)胞培養(yǎng)期間粘附在結(jié)構(gòu)上并在水凝膠基質(zhì)內(nèi)生長。同時，作者在28天的培養(yǎng)期間，根據(jù)ALP活性（圖7C）和OC分泌（圖7D）評估生物打印ADA-GEL/FS水凝膠內(nèi)MC3T3-E1細(xì)胞的分化。

圖7 3D 生物打印水凝膠內(nèi)的MC3T3-E1細(xì)胞和FS顆粒相互作用以及ADA-GEL/FS生物打印水凝膠的分化研究

綜上，本文介紹了一種由ADA-GEL和FS顆粒組成的生物墨水配方，作為骨再生的有潛力的候選材料。在材料特性、細(xì)胞相容性和成骨分化方面研究了將FS 顆粒添加到 ADAGEL 基質(zhì)中的影響。FS 顆粒均勻分布到 3D 生物打印的水凝膠中，并顯示出與 ADA-GEL 的適當(dāng)相互作用。生物打印的ADA-GEL/FS 復(fù)合水凝膠表現(xiàn)出生物活性以及對MC3T3-E1細(xì)胞有利的微環(huán)境。此外，F(xiàn)S 顆粒的摻入還增加了前成骨細(xì)胞的細(xì)胞增殖和成骨分化。細(xì)胞相容性、與骨骼相似的生化成分、獨特的膠原纖維取向、羥基磷灰石含量的天然生物礦化能力以及方便的印刷特性使ADA-GEL/FS 成為一種很有前途的骨修復(fù)生物材料。

文章來源：
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/acb6b7