浙江大學(xué)賀永團(tuán)隊(duì)：同軸生物3D打印構(gòu)建可灌注血管芯片

來源：EngineeringForLife  

血管芯片這一概念正日益受到重視，因其可用于研究微尺度流體動(dòng)力學(xué)、組織級(jí)別的生物分子傳遞以及良好三維細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境下的細(xì)胞間通信。然而目前少有血管芯片能做到長(zhǎng)期穩(wěn)定灌流，并著眼于血管新生過程。由于血管新生是腫瘤發(fā)展的必要條件，抗血管新生藥物一直在癌癥治療中發(fā)揮著重要作用。我們以同軸生物打印為工具，構(gòu)建了一種新穎、可靠的抗血管新生藥物篩選血管芯片，該芯片高度模塊化集成，能用于灌流培養(yǎng)和實(shí)時(shí)觀測(cè)。為了在保證良好生物活性的前提下維持載細(xì)胞管的液體灌通，受到心臟支架的啟發(fā)，在水凝膠管內(nèi)引入了聚己內(nèi)酯（PCL）支架用于支撐管腔。結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)監(jiān)控系統(tǒng)，系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)血管新生過程的實(shí)時(shí)觀測(cè)。這項(xiàng)工作開發(fā)了一種用于抗血管新生篩藥的灌流系統(tǒng)，不僅可以進(jìn)行藥物評(píng)估，而且在組織工程、藥代動(dòng)力學(xué)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的其他血管模擬場(chǎng)景中也有潛在的用處。

相關(guān)研究“Perfusable Vessel-on-a-Chip for Antiangiogenic Drug Screening with Coaxial Bioprinting”近期發(fā)表在International Journal of Bioprinting雜志上，浙大機(jī)械學(xué)院顧則明博士為第一作者，浙大機(jī)械學(xué)院賀永教授和謝超淇博士后為共同通訊作者。

圖1 血管新生模型的灌流系統(tǒng)及其生理機(jī)制

血管芯片的構(gòu)建流程如下：1. 同軸生物打印載內(nèi)皮細(xì)胞的水凝膠管；2. 將載細(xì)胞管切成小段并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-7天，待內(nèi)皮細(xì)胞伸展、增殖形成內(nèi)皮化類血管；3. 旋轉(zhuǎn)打印PCL支架；4. 將PCL支架脫模并滅菌；5. 將PCL支架插入內(nèi)皮化類血管結(jié)構(gòu)中；6. 用含VEGF的GelMA生物墨水包裹類血管結(jié)構(gòu)在預(yù)先準(zhǔn)備的聚乳酸（PLA）框架中澆筑成水凝膠塊；7. 將水凝膠塊放入芯片中，連接上進(jìn)出口，用螺栓緊固后即可進(jìn)行灌流培養(yǎng)。

圖2 可灌注血管芯片的構(gòu)建

我們采用生物友好型聚合物PDMS壁和螺栓緊固的安裝方式，有效地實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)期灌流培養(yǎng)而無漏液、無污染�；�于灌流腔室的精巧設(shè)計(jì)，裝載著水凝膠塊的PLA框架限位與PLA底板上，而PLA底板又與PDMS壁四角相抵，水凝膠塊在灌流過程中六個(gè)方向填充著培養(yǎng)基，確保了水凝膠塊和培養(yǎng)基之間全方位的充分接觸，為水凝膠中的細(xì)胞提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。空心金屬蓋板和透明PET薄膜的使用為血管芯片提供了一個(gè)可觀察的窗口。在細(xì)胞培養(yǎng)監(jiān)控系統(tǒng)的幫助下，在灌流培養(yǎng)過程中可實(shí)時(shí)觀察內(nèi)皮細(xì)胞的出芽區(qū)域。只要事先設(shè)置好合適的焦距和范圍，監(jiān)控系統(tǒng)就會(huì)從培養(yǎng)箱中實(shí)時(shí)傳回出芽區(qū)域的圖像。此外，得益于可快拆的連接接口，該模塊化灌流芯片可以很容易地從灌注系統(tǒng)中分離出來，放在顯微鏡下觀察，而不會(huì)造成污染。

圖S3 可快拆的灌流芯片

出于優(yōu)化同軸生物打印過程中的打印參數(shù)、精確構(gòu)建載細(xì)胞管的目的，我們分析了明膠和GelMA生物墨水的流變特性，明確了明膠/GelMA生物墨水在升溫與降溫過程中不同凝膠點(diǎn)，這為打印過程中的溫度控制提供了指導(dǎo)。此外，流速分析也確定了最終打印的內(nèi)外徑流速與噴嘴的尺寸。

圖3 GelMA/gelatin生物墨水的可打印性分析

在生物3D打印中，水凝膠結(jié)構(gòu)的生物相容性與結(jié)構(gòu)強(qiáng)度一直是兩個(gè)難以調(diào)和的對(duì)立面。我們?cè)诒卷?xiàng)研究中引入了PCL支架用以支撐起柔軟適合細(xì)胞生長(zhǎng)的水凝膠結(jié)構(gòu)就同時(shí)實(shí)現(xiàn)了良好的生物活性與灌流通道的無坍塌、無堵塞。我們從力學(xué)強(qiáng)度、溶脹后變形程度、不同流速的貫通測(cè)試等角度對(duì)比了有無PCL支架對(duì)水凝膠結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果都證實(shí)了PCL支架的必要性。

圖4 有無PCL支架支撐的對(duì)比分析

為了表征水凝膠材料的擴(kuò)散滲透性和內(nèi)皮化預(yù)制血管的屏障功能，我們?cè)谙嗤瑮l件下測(cè)試了無細(xì)胞水凝膠管與內(nèi)皮化類血管結(jié)構(gòu)的FITC標(biāo)記的葡聚糖擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明了GelMA優(yōu)秀的滲透擴(kuò)散能力以及載細(xì)胞類血管結(jié)構(gòu)中HUVEC之間的緊密連接已形成了良好的屏障功能。

圖5 內(nèi)皮化水凝膠管的屏障功能

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該內(nèi)皮化類血管結(jié)構(gòu)的功能化，我們對(duì)載細(xì)胞水凝膠管進(jìn)行了細(xì)胞活性表征，包括擴(kuò)散、增殖分析等。該內(nèi)皮化水凝膠管的三個(gè)視圖和橫截面視圖的共聚焦圖像顯示了內(nèi)皮細(xì)胞在生物打印的血管中均勻分布以及HUVEC之間的緊密細(xì)胞間連接。再構(gòu)建完血管芯片并灌流培養(yǎng)3天以后，我們對(duì)載細(xì)胞水凝膠結(jié)構(gòu)進(jìn)行了免疫熒光染色分析。細(xì)胞外基質(zhì)中的黏附蛋白vinculin的出現(xiàn)證實(shí)了HUVECs與水凝膠之間產(chǎn)生了牢固的黏附，而ZO-1抗體的表達(dá)則顯示了相當(dāng)緊密的細(xì)胞-細(xì)胞連接。

圖6 載細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物活性表征

在水凝膠塊澆筑時(shí)加入的VEGF（200 ng/ml）為內(nèi)皮化類血管中的HUVEC提供了方向性指導(dǎo)，在隨后的灌流培養(yǎng)期間，細(xì)胞感應(yīng)到VEGF的梯度濃度并開始向外出芽。灌流培養(yǎng)3天后，通過共聚焦熒光顯微鏡圖像和光學(xué)圖像可以清楚地觀察到HUVEC的出芽。在細(xì)胞培養(yǎng)監(jiān)控系統(tǒng)的幫助下，在灌流的前48小時(shí)HUVEC的出芽過程被清晰地記錄下來。

貝伐單抗是一種針對(duì)VEGF的重組人源化單克隆抗體，已被證明在腫瘤治療中有效。它會(huì)搶先與VEGF結(jié)合并抑制其與VEGFR結(jié)合，從而阻止腫瘤血管的維持或發(fā)展。我們采用了三種濃度的貝伐單抗與對(duì)照組通過灌流系統(tǒng)進(jìn)行藥物篩選：10 ng/ml、50 ng/ml和100 ng/ml。灌流培養(yǎng)3天后，不同濃度的貝伐單抗的HUVEC出芽水平不同，與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)。對(duì)于不含貝伐單抗的對(duì)照組，HUVEC出芽旺盛，而灌注100 ng/ml貝伐單抗的樣品幾乎沒有出芽�；�于這四組模型的光學(xué)圖像，我們對(duì)不同藥物濃度灌流培養(yǎng)的HUVEC出芽還進(jìn)行了定量分析。同一視野中出芽數(shù)的差異是巨大的，而出芽平均長(zhǎng)度的差異并不大，此外出芽的相對(duì)面積也得到了評(píng)估，可能由于出芽數(shù)量存在較大差距，相對(duì)面積隨著貝伐單抗?jié)舛鹊淖兓�也呈現(xiàn)出顯著差異。

圖7 抗血管新生篩藥模型的應(yīng)用

文章來源：
http://doi.org/10.18063/ijb.v8i4.619