受齒輪形狀啟發(fā)的3D 打印生物支架：用于免疫調(diào)節(jié)和骨再生

來源：EngineeringForLife  

免疫調(diào)節(jié)和成骨微環(huán)境對(duì)骨組織的三維再生具有重要意義。三維支架具有不同的化學(xué)成分、大孔結(jié)構(gòu)和表面特征，為骨組織再生提供了有利的微環(huán)境。然而，生物陶瓷支架有序的表面微結(jié)構(gòu)與骨再生的免疫微環(huán)境之間存在差距。在這項(xiàng)研究中，中國科學(xué)院大學(xué)上海硅酸鹽研究所吳成鐵課題組等通過一種改進(jìn)的基于擠出的3D打印策略，成功地制備了具有良好表面微結(jié)構(gòu)的齒輪啟發(fā)的3D支架，用于免疫調(diào)節(jié)和骨再生。制備的齒輪支架可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2表型極化以減輕炎癥，進(jìn)一步促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化以形成新骨。在骨組織工程和再生醫(yī)學(xué)的免疫調(diào)節(jié)和成骨微環(huán)境中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。相關(guān)研究 “3D Printing of Gear-inspired Biomaterials: Immunomodulation and Bone Regeneration”于2022年9月12日發(fā)表在雜志《Acta Biomaterialia》上。  

研究表明，具有免疫調(diào)節(jié)特性的生物材料可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的適當(dāng)反應(yīng)，從而釋放細(xì)胞因子，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，最終促進(jìn)新骨形成。因此，構(gòu)建免疫調(diào)節(jié)性和成骨微環(huán)境對(duì)骨組織的三維再生具有重要意義。本文通過改進(jìn)的3D打印技術(shù)成功地制備了具有良好表面微結(jié)構(gòu)的齒輪狀3D生物陶瓷支架，用于系統(tǒng)地調(diào)節(jié)骨組織工程領(lǐng)域中的免疫和成骨微環(huán)境。

1. 不同齒輪狀結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)與制備
為了在生物陶瓷支架上構(gòu)建齒輪啟發(fā)的微結(jié)構(gòu)，使用改進(jìn)的基于擠壓的3D打印技術(shù)的噴嘴設(shè)備，圖1為齒輪狀支架及其制造設(shè)備的示意圖和實(shí)物圖。

圖1 改進(jìn)型噴嘴和齒輪式支架的形態(tài)

2. 基于齒輪結(jié)構(gòu)的生物陶瓷支架的三維打印與表征
為了探索齒輪狀生物陶瓷支架表面微結(jié)構(gòu)的生物學(xué)功能，制備了兩個(gè)不同系列的結(jié)構(gòu)變量(不同溝槽寬度或深度)的齒輪生物陶瓷支架(圖2A)。以沒有任何齒輪微結(jié)構(gòu)的普通支架 (光滑) 作為對(duì)照材料 (圖2A) 。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這種改進(jìn)的3D打印技術(shù)的普適性，成功地制備了不同微觀結(jié)構(gòu)(圖2B)、不同原材料 (圖2C) 和內(nèi)槽結(jié)構(gòu) (圖2D) 的支架。由于β-磷酸三鈣(β-TCP)具有良好的生物相容性、成骨性能和廣泛的臨床應(yīng)用前景，本研究以其為主要基質(zhì)材料。

圖2 各種齒輪啟發(fā)的支架的形態(tài)

3. 受齒輪啟發(fā)支架的體外生物學(xué)評(píng)價(jià)
已經(jīng)證明，微尺度的形態(tài)對(duì)細(xì)胞的行為和命運(yùn)有影響。在此，研究了不同齒輪狀生物陶瓷支架對(duì)RAW267.4細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性以及這些支架對(duì)RBMSCs的成骨活性。如激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)圖像所示，齒輪生物陶瓷支架分別對(duì)RAW264.7細(xì)胞(圖3A)和RBMSCs(圖3B)表現(xiàn)出不同的作用。結(jié)果表明，盤狀組件的溝槽寬度為20μm (G20) 時(shí)，支架對(duì)上述細(xì)胞具有最好的延伸性和定向效果。采用CCK-8法檢測細(xì)胞在齒輪啟發(fā)支架上的增殖活性。如圖3C和D所示，所有支架都表現(xiàn)出較好的生物相容性，可以顯著促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的增殖，而RBMSCs的增殖活性略低于對(duì)照組。

圖3 RAW264.7細(xì)胞和RBMSCs在不同齒輪狀支架上的形態(tài)和增殖情況

為了探討齒輪生物陶瓷支架的免疫調(diào)節(jié)特性和成骨特性，進(jìn)行了實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)實(shí)驗(yàn)。將RAW264.7細(xì)胞負(fù)載于不同齒輪的生物陶瓷支架上，孵育2天。如圖4A和圖B所示，白細(xì)胞介素18(IL-18)的表達(dá)在G20組顯著下調(diào)。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(INOS)在G20組表達(dá)下調(diào)，除促炎基因外，還檢測到抗炎基因精氨酸酶-1(Arg-1) 的表達(dá)僅在G20組顯著上調(diào)。白細(xì)胞介素1受體拮抗劑(IL-1ra)的表達(dá)在G20組明顯上調(diào)。以上結(jié)果表明，G20的抗炎效果最好，且穩(wěn)定。為了進(jìn)一步研究齒輪生物陶瓷支架的成骨性能，將RBMSCs種植在不同的支架上，培養(yǎng)7d。成骨相關(guān)基因的表達(dá)如圖4C和D所示。骨鈣素(OCN)基因在G20組的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，表明具有相當(dāng)?shù)某晒腔钚浴?br />
除了RAW264.7細(xì)胞和RBMSCs的單一培養(yǎng)外，還建立了共培養(yǎng)體系，以探討齒輪生物陶瓷支架的免疫調(diào)節(jié)作用。以G20支架為實(shí)驗(yàn)組，選擇光滑支架為對(duì)照組。如圖4E所示，將裝有RAW264.7細(xì)胞的光滑支架或G20支架放置在Transwell小室中，同時(shí)將RBMSCs種植在平板上。共培養(yǎng)2天后，實(shí)驗(yàn)組RBMSCs OCN、骨橋蛋白(OPN)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 (RUNX2) 和BMP-2的基因表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(圖4F)，表明齒輪狀生物陶瓷支架上的RBMSCs與RAW264.7共培養(yǎng)能有效促進(jìn)成骨分化。

圖4 齒輪狀支架免疫調(diào)節(jié)性能和成骨性能的體外生物學(xué)評(píng)價(jià)

4. 受齒輪啟發(fā)支架的體內(nèi)生物學(xué)評(píng)價(jià)
為了進(jìn)一步研究齒輪生物陶瓷支架的體內(nèi)抗炎和成骨性能，建立了小鼠皮下植入模型和兔股骨骨缺損模型。選擇空白、光滑和G20三組進(jìn)行研究。如圖5所示，空白組幾乎沒有炎癥反應(yīng)。此外，與光滑組相比，G20組齒輪式生物陶瓷支架能促進(jìn)結(jié)締組織和血管進(jìn)入支架內(nèi)腔。

圖5 齒輪支架免疫調(diào)節(jié)特性的體內(nèi)生物學(xué)評(píng)價(jià)

在建立小鼠皮下植入模型的基礎(chǔ)上，建立兔股骨缺損區(qū)模型，研究齒輪激勵(lì)生物陶瓷支架的體內(nèi)成骨能力。手術(shù)8周后，所有的兔都被安樂死，并采集樣本進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)估(圖6A)。如圖6B所示，相比于空白組，G20組支架(紅色)內(nèi)部有更多的新生骨(綠色)。Micro-CT統(tǒng)計(jì)分析顯示，G20組的骨體積/總體積(BV/TV)值顯著高于空白組和光滑組(圖6C)。

圖6 齒輪狀支架成骨性能的體內(nèi)生物學(xué)評(píng)價(jià)

此外，Van-Gieson染色顯示G20組新生骨(紅色)多于空白組和光滑組(圖7)。VG染色切片中新生骨面積的定量分析也表明，G20組的成骨性能好于空白組和光滑組。

圖7 新生骨的Van-Gieson染色(紅色)

綜上所述，通過基于擠壓的3D打印策略，成功地制備了具有不同齒輪結(jié)構(gòu)的生物陶瓷支架。3D打印策略在組織工程和再生醫(yī)學(xué)的許多領(lǐng)域展示了多功能性和潛力。此外，齒輪狀生物陶瓷支架在體外和體內(nèi)都表現(xiàn)出良好的免疫調(diào)節(jié)和成骨活性。該研究提出了一種制造齒輪生物陶瓷支架的有前景的策略，將免疫和成骨微環(huán)境整合到三維有序微結(jié)構(gòu)中，有望用于免疫調(diào)節(jié)和骨組織工程。

文章來源：
https://www.sciencedirect.com/sc ... 22005694?via%3Dihub