利用SUNP BP11低溫沉積3D打印含多級孔隙結(jié)構(gòu)

來源：上普生物

骨組織工程(BTE)是一種快速發(fā)展的可治療各種尺寸骨缺損的方法。該方法的主要研究內(nèi)容圍繞在骨支架周圍，具體為支架如何提供便于細胞粘附的生物和物理框架，誘導骨分化和促礦化基質(zhì)沉積。近日，一篇名為“Low-Temperature Printed Hierarchically Porous Induced-Biomineralization Polyaryletherketone Scaffold for Bone Tissue Engineering”的文章由長春應用化學所的欒世方教授研究團隊在Advanced Healthcare Materials (IF=11.09)上發(fā)表。該研究展示了一種利用SUNP ALPHA-BP11低溫沉積制造的PAEK-COOH骨支架，該支架具有與松質(zhì)骨相似的力學強度，同時具有從納米到微米尺度可控的多級孔隙結(jié)構(gòu)促進細胞粘附和羧基通過靜電相互作用誘導羥基磷灰石礦化，加速體內(nèi)骨形成。

背景介紹
支架材料是骨組織工程的重要組成部分，其必須滿足與天然骨匹配的生物活性和力學性能。細胞粘附和羥基磷灰石(HA)礦化是骨形成的關(guān)鍵生物學階段。針對第一個階段，具體策略有使用表面含納米孔的支架促進細胞粘附，擴散和成骨分化，此外，向支架外開放和相互連接的孔(數(shù)百微米)有利于營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子的運輸，進一步促進支架內(nèi)部的細胞生長，血管化和廢物代謝。即具有納米至微米尺度孔的多孔支架在骨形成的早期階段是有效的。針對第二個階段，已經(jīng)發(fā)表了許多解釋生物礦化的假說闡述生物礦物沉積在成骨過程中是至關(guān)重要的，包括大分子識別、模板控制、成骨細胞介導、靜電吸附等。因此，誘導羥基磷灰石礦化的功能性生物材料具有重要意義。

聚醚醚酮(PEEK)是一種高性能的半結(jié)晶性樹脂，其彈性模量類似于天然骨骼。由于其優(yōu)異的力學性能、耐化學性和生物相容性，聚醚醚酮是臨床骨科和脊柱應用的主要組成部分。然而，PEEK 在生物學上是惰性的，不利于與周圍骨組織的預期結(jié)合，阻礙了正常的骨生長。為了解決這一問題，研究人員開發(fā)了包括表面修飾和復合材料的制備在內(nèi)的多種方法，來改善 PEEK植入物的骨整合。然而，PEEK具有芳香族分子骨架，在芳基環(huán)之間有酮和醚官能團，密集排列在聚合物鏈之間。這些特殊的分子結(jié)構(gòu)使得 PEEK 具有較好的穩(wěn)定性，難以進行改性。當然，聚醚醚酮的表面可以被腐蝕性酸(例如濃硫酸)腐蝕，因此轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗫捉Y(jié)構(gòu)。然而，腐蝕性酸很難完全清除，因此殘留的有毒成分會導致細胞和組織損傷。另一種修飾策略是在 PEEK 表面接枝官能團。然而，這一過程過于冗長均一性差。此外，將生物活性材料(如納米羥基磷灰石顆粒)浸漬到聚醚醚酮(PEEK)復合材料中已經(jīng)成為一種提高 PEEK 生物活性的高效方法。然而，由于界面粘結(jié)力差，添加劑活性材料的復合材料中容易出現(xiàn)界面失效和疲勞損傷，隨后基體裂紋從填料-基體結(jié)合部位開始萌生和擴展。隨后，較短的裂紋發(fā)展成為較長的基體裂紋從而來，從而破壞結(jié)構(gòu)。PEEK 表面上的生物活性涂層是另一種有效的方法，一些生物活性因子(如抑菌劑)可以被裝載到涂層中，并在植入體內(nèi)時釋放起積極作用，從而賦予惰性 PEEK 植入物生物活性。

本文基于活性涂層的理念提出并合成了一種含羧基的無定形聚芳醚酮(PAEK-COOH)，它是通過親核取代反應縮聚反應合成的。該聚合物溶于有機溶劑通過SUNP ALPHA-BP11低溫沉積3D打印機一步制備 PAEK-COOH 多級孔隙支架材料，力學強度與松質(zhì)骨相似，支架具有從納米到微米尺度可控的微觀結(jié)構(gòu)。相比于熔融沉積成型(FDM)打印的 PEEK 支架，低溫沉積打印的 PAEK-COOH 支架具有納米孔表面促進細胞粘附和羧基通過靜電相互作用誘導 HA 礦化，加速體內(nèi)骨形成(圖1)。

圖1. 研究路線示意

a) PAEK-COOH的合成工藝及打印墨水制備。b)低溫沉積打印PAEK-COOH 多級孔隙支架，有利于細胞粘附和羥基磷灰石礦化。c)植入的支架在體內(nèi)誘導骨形成。

實驗過程與結(jié)果
1. 材料合成與可打印性表征
以苯酚酞(PPH)和4,4’-二氟二苯甲酮(DFBP)在二甲基亞砜(DMSO)中進行親核取代反應縮聚反應，并以二甲基亞砜(K2CO3)為催化劑合成了 PAEK-COOK (圖2)，經(jīng)鹽酸酸化后獲得 PAEK-COOH。在 X 射線衍射分析(XRD)圖樣(圖2b)中，在≈20度處出現(xiàn)一個單峰和寬峰，表明 PAEK-COOH 是一種無定形聚合物。這是由于側(cè)鏈的苯環(huán)和羧基破壞了聚合物鏈的規(guī)則性。由于存在側(cè)鏈，溶劑(例如1,4-二氧六環(huán))可以輕易穿透聚合物內(nèi)部，因此無定形的 PAEK-COOH 可以溶解在1,4-二氧六環(huán)中(圖2b)。隨后，可以通過調(diào)節(jié)溶劑獲得不同的生物墨水濃度(包括 PAEK-COOH 和1,4-二氧六環(huán))(圖2e)用于滿足可打印性的要求。

圖2.PAEK-COOH 的合成及生物墨水的可打印性。a)通過親核取代反應縮聚反應合成 PAEK-COOH 的方案。b) PAEK-COOH 的 XRD 譜圖和溶劑溶解聚合物鏈的示意圖。c)在剪切速率范圍內(nèi)(10-1-102s-1)生物油墨的表觀粘度。d)在不同剪切速率下，1000s內(nèi)生物墨水的流變特性(濃度為20%g mL-1)。e)不同濃度的生物墨水(單位: g mL-1)的照片。f)3D 打印過程中的流變剪切力示意圖(F: 剪切力)。g)通過掃描電鏡觀察不同濃度墨水所得支架的孔隙分布和尺寸大小，經(jīng)Image J處理得到圖h)。比例尺 = 20微米。

2. 含多級孔隙骨支架制造及其性能表征
含多級孔隙骨支架是通過SUNP ALPHA-BP11低溫沉積3D打印機制備的。打印過程中材料在足夠的冷凍溫度下將縫隙中的溶劑轉(zhuǎn)化為冰晶。在特定的溫度和壓力的后續(xù)凍干程序中，冰晶升華成蒸汽，殘留溶劑被消除，產(chǎn)生多孔支架，該技術(shù)可以制造任何形狀的個性化支架(圖3a，b)。值得一提的是，該技術(shù)同樣可以打印具有梯度結(jié)構(gòu)的多孔支架(圖3b)，模仿真實的骨結(jié)構(gòu)。

圖3. 從宏觀到微觀的3D打印多級孔隙支架結(jié)構(gòu)。a)由 BioMakerV2設計的多孔支架的三維模型。b) 以PAEK-COOH為基體材料的3D打印多孔支架。c)支架的二維切片及顯微 CT 掃描后的三維重建結(jié)構(gòu)。d)Image J處理的不同結(jié)構(gòu)孔隙的掃描電鏡圖像和表面輪廓儀掃描獲得的2D e)和 3D f)表面形貌圖像。

通過熔融沉積成型(FDM)方法制造聚醚醚酮(PEEK)支架，以便與低溫沉積打印的PAEK-COOH 支架進行比較。表面 SEM 圖像顯示了支架之間的差異：首先，這兩種支架在低放大倍率都呈現(xiàn)出規(guī)則的外觀為正交排列的纖維，然而在高倍放大的影像中，低溫沉積支架呈現(xiàn)出多孔結(jié)構(gòu)，這是由于在冷凍干燥過程中溶劑被移除的。AFM 圖像驗證了這些表面微觀結(jié)構(gòu)差異。由于材料表面微觀結(jié)構(gòu)的差異，材料的比表面積和親水性獲得提高。與FDM支架(111.08°± 3.85°)相比，LDM支架(80.54°±2.45°)的水接觸角顯著降低(圖4d)。這是因為納米孔表面和羧基的存在改善了支架的親水性。此外，與 FP 相比，LP 支架表現(xiàn)出較低的密度和較大的細胞粘附的比表面積(圖4e)。除了生物活性，支架的力學性能也應該與真實骨骼相匹配，從而防止應力屏蔽。在相同的孔隙率下(圖4c，f) ，LDM支架的壓應力(6.15MPa±0.45MPa)與松質(zhì)骨(2-12MPa)顯著匹配。

圖4. 不同支架結(jié)構(gòu)和性能的比較。A)熔融沉積組和低溫沉積組支架在不同放大倍數(shù)下的掃描電鏡圖像。b)利用原子力顯微鏡進行三維表面粗糙度測量(RMS：均方根)。c) 熔融沉積組,低溫沉積組,純PLGA材料組支架壓縮應力-應變曲線 (壓縮速度：1mm/min)。d)接觸角比較。e)比表面積比較（BET 法計算）。F)具有相同孔隙率的熔融沉積組,低溫沉積組,純PLGA材料組支架的壓縮模量。g)采用同一夾具擠壓低溫沉積支架和凍干GelMA凝膠支架。每組 n = 5。* * P < 0.01.

3. 利用體外實驗觀察支架對成骨細胞行為的調(diào)控
根據(jù) SEM 圖像的觀察，我們注意到在不同支架上培養(yǎng)的MC3T3-E1細胞的細胞粘附和擴散形態(tài)有相當大的變化(圖5a-d)。具體來說，LDM支架表面納米多孔結(jié)構(gòu)使細胞呈現(xiàn)典型的多邊形和相對拉伸的形態(tài)，大量的細胞絲狀偽足與基質(zhì)支架緊密相連。納米孔類似于細胞絲狀偽足的附著點，調(diào)控細胞行為。之后，在LDM支架表面納米孔作用下，MC3T3-E1沿著支架纖維粘附和遷移。盡管如此，然而在熔融沉積支架表面沒有觀察到類似狀態(tài)，僅觀察到具有少量突起的近球形細胞，并且一些細胞凋亡。

圖5. 具有納米孔表面的低溫沉積支架促進細胞附著。a-d) SEM 圖像顯示24小時后在熔融沉積 (a，b)和 低溫沉積 (c，d)支架上培養(yǎng)的 MC3T3-E1細胞的細胞擴散形態(tài)。比例尺 = 20μm (a，c)和5μm (b，d)。e-h) 共聚焦掃描圖像顯示3天后通過活/死亡測定在熔融沉積 (e，f)和低溫沉積(g，h)支架上培養(yǎng)的 MC3T3-E1細胞的細胞分布。比例尺 = 200μm (e，g)和50μm (f，h)。i)細胞行為的示意圖，接種后粘附在支架上。j) MC3T3-E1細胞在不同3D 打印支架上的增殖差異。k-n)成骨相關(guān)基因(ALP，OPN，OCN，COL-1)的相對表達。每組 n = 3。* P < 0.05，* * P < 0.01.

4. 支架誘導羥基磷灰石礦化原理分析
在模擬體液(SBF)中浸泡后，X射線光電子能譜(XPS)被用來分析支架上的元素含量。1天后，在 LDM支架上觀察不到明顯的 Ca 2p 和 P 2p 峰，2天后，LDM支架光譜出現(xiàn)了 Ca2p 峰，但沒有高分辨率的 P2p 峰，3天后，光譜中出現(xiàn)了強烈的 Ca2p 和 p2p 峰，意味著支架表面形成了磷酸鈣團聚體(圖6b，c)。研究結(jié)果表明，在LDM支架上富集的羧基促進了 HA 晶體在模擬體液環(huán)境中的成核。這與膠原細胞外間質(zhì)的自然骨形成相似。這是由于PAEK-COOH 的羧基電離而產(chǎn)生負電荷吸引下帶正電荷的鈣離子，隨著鈣離子的逐漸積累，支架表面獲得正電荷，并選擇性地吸附帶負電荷的磷酸根離子形成包含磷酸鈣的不均勻成核，繼續(xù)自發(fā)生長后，成為穩(wěn)定的骨樣羥基磷灰石晶體。

圖6.模擬體液中羥基磷灰石礦物的形成。a)靜電吸附促進羥基磷灰石在低溫沉積支架上沉積的機理。X 射線光電子能譜(XPS)測量一定浸泡時間后低溫沉積支架上的 b Ca2p和c) P2p分布，及對應元素在熔融沉積支架上的分布d)，e)；f)羥基磷灰石沉積在熔融沉積和低溫沉積支架表面的SEM圖像和EDS分析。

5. 兔體內(nèi)實驗驗證骨修復效果
低溫沉積支架周圍的新骨組織比熔融沉積支架更豐富。此外，HE 染色結(jié)果(圖7i)表明，新的骨組織在4周后開始在支架表面生長，在8周后在支架周圍形成大量的新骨組織，Goldner 三色染色結(jié)果(圖7j)表明低溫沉積支架組在支架周圍充滿了大量的礦化(藍綠色)骨組織。即低溫沉積打印形成的支架由于其優(yōu)良的骨誘導能力，可以有效地促進骨再生，在缺損區(qū)域形成更好的新骨組織的骨連接。

圖7. 體內(nèi)骨再生分析。a)直徑5毫米、深度6毫米的支架植入過程示意圖。b)二維和三維的micro CT重建圖像顯示植入熔融沉積和低溫沉積打印支架兩組的骨再生情況。(新形成的骨組織呈現(xiàn)紅色)。c-g)通過測量(c)骨體積分數(shù)，(d)骨礦化程度，(e)骨小梁分離，(f)骨小梁數(shù)和(g) 骨小梁厚度來定量分析再生骨組織。h)8周后不同支架的拉脫力。i，j) HE和戈德納染色圖像顯示骨修復周圍的缺損處理與不同的支架。(S: 支架; NB: 新形成的骨組織; 黃色箭頭表示沿支架新形成的骨)。每組 n = 3。* P < 0.05，* * P < 0.01.

結(jié)論
該研究通過SUNP BP11低溫沉積3D打印機成功地制備了具有多級孔隙的PAEK-COOH 骨修復支架。該支架具有從納米級到微米級的可控微結(jié)構(gòu)，力學強度滿足承重骨小梁的要求。含納米孔的支架表面能促進細胞粘附、擴散、分化，提高成骨能力。同時由于支架表面帶負電的羧基與鈣離子之間存在靜電引力相互作用，有利于羥基磷灰石晶體的形成。植入兔體內(nèi)缺損部位的低溫沉積支架具有更豐富的新生骨組織和更高的骨礦化度，表明其能有效促進骨再生，并能在缺損區(qū)域形成新骨組織的良好骨連接。盡管該方法顯示出顯著的優(yōu)勢，但仍然存在一些局限性。骨形成是一個復雜的過程，該研究只考慮了細胞行為和生物礦化的影響，未討論其他關(guān)鍵因素，如免疫調(diào)節(jié)和血管化。

值得一提的是，該公眾號上期推文3D-printed scaffold with halloysite nanotubes laden as a sequential drug delivery system regulates vascularized bone tissue healing中研究了促血管生成對骨修復的關(guān)鍵作用，且使用工具同為SUNP BP11低溫沉積3D打印機。這兩篇研究分別地從微觀物理拓撲結(jié)構(gòu)，生物礦化和生物化學因子誘導的方面證明了低溫沉積支架在骨組織工程方面的獨特優(yōu)勢，供讀者參考。

參考文獻
Gao X, Wang H, Luan S, et al. Low‐Temperature Printed Hierarchically Porous Induced‐Biomineralization Polyaryletherketone Scaffold for Bone Tissue Engineering[J]. Advanced Healthcare Materials, 2022: 2200977.
https://doi.org/10.1002/adhm.202200977