微流控流式細(xì)胞打印技術(shù)，制備功能性肝細(xì)胞微球

來(lái)源 : EngineeringForLife  


三維培養(yǎng)的多細(xì)胞肝臟微球模型有利于肝纖維化治療的發(fā)展。雖然這些模型可以再現(xiàn)纖維化疾病，但目前通過(guò)隨機(jī)聚集產(chǎn)生微球方法是不受控制的，較易產(chǎn)生大小、功能和效用不穩(wěn)定的球體。生物3D打印可以建立自動(dòng)化成型，簡(jiǎn)化過(guò)程和增加可靠性。然而，艙室的加載仍然是隨機(jī)的，產(chǎn)生了不均勻的組成和功能性質(zhì)的微球。這種可變性降低了使用微球進(jìn)行篩選的準(zhǔn)確性和靈敏度。

為了實(shí)現(xiàn)卓越的體外肝臟建模，需要建立新的方法來(lái)創(chuàng)建具有可控結(jié)構(gòu)、成分和功能特性的微球。近日，來(lái)自美國(guó)加利福尼亞大學(xué)的Adam R Abate團(tuán)隊(duì)利用微流控流式細(xì)胞打印技術(shù)（µFCP）成功制造了精密肝臟細(xì)胞微球。所產(chǎn)生的細(xì)胞球體具有優(yōu)越的功能均勻性，與隨機(jī)生成的球體相比，具有更準(zhǔn)確的統(tǒng)計(jì)窗口。相關(guān)研究以“Controlled fabrication of functional liver spheroids with microfluidic flow cytometric printing”為題于2022年8月2日在線發(fā)表在Biofabrication上。

圖1 微流控流式細(xì)胞打印技術(shù)產(chǎn)生肝細(xì)胞微球示意圖

首先，作者將肝細(xì)胞（HepG2）細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶處理后，通過(guò)26G針三次，使細(xì)胞團(tuán)塊斷裂，制成單個(gè)HepG2細(xì)胞懸液。同樣，肝星狀細(xì)胞（HSC）也經(jīng)胰酶和EDTA消化為單細(xì)胞懸液�；�于微流控芯片開(kāi)發(fā)的單細(xì)胞打印機(jī)可通過(guò)定制的LabVIEW界面實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。作者采用康寧的6孔或384孔的圓底超低粘附微孔板作為印刷或被動(dòng)加載基板。利用懸浮細(xì)胞制備細(xì)胞微球的一個(gè)挑戰(zhàn)是，不是所有的細(xì)胞都是活的。因此，使用隨機(jī)分隔技術(shù)，死亡的細(xì)胞包含在種子中，引入可以改變球形性質(zhì)的可變性。用活性染料可以丟棄死細(xì)胞，這是一種獨(dú)特而有價(jià)值的特性（圖2）。

圖2 與隨機(jī)沉淀法相比，產(chǎn)生的細(xì)胞存活率和均勻度更高

球形大小由培養(yǎng)時(shí)間和種子中起始細(xì)胞的數(shù)量決定。為了說(shuō)明µFCP在控制球體大小方面的效用，作者打印出具有不同細(xì)胞數(shù)量的種子，并監(jiān)測(cè)它們的生長(zhǎng)，與隨機(jī)加載相比，最終的大小變異性要小約3倍。為了說(shuō)明準(zhǔn)確控制其成分的能力，我們使用兩種方法構(gòu)建了含有10個(gè)HepG2和10個(gè)造血干細(xì)胞的目標(biāo)成分的球體。對(duì)于µFCP， HepG2細(xì)胞平均10.4個(gè)，HSC細(xì)胞平均10.1個(gè)，標(biāo)準(zhǔn)誤差分別為0.9和0.8。對(duì)于隨機(jī)加載，根據(jù)泊松分布，我們觀察到HepG2細(xì)胞平均數(shù)量為9.4，HSC細(xì)胞平均數(shù)量為9.9，標(biāo)準(zhǔn)誤差分別為3.4和3.6。因此，印刷的球體比隨機(jī)加載產(chǎn)生的球體尺寸變異性低三倍。

圖3 采用微流控單細(xì)胞打印技術(shù)制備多細(xì)胞肝球，得到更加均勻的多細(xì)胞肝臟微球

纖維形成依賴于肝細(xì)胞與造血干細(xì)胞的相互作用。因此，這些細(xì)胞的比例變化可導(dǎo)致不規(guī)則的球形功能。為了研究細(xì)胞比例對(duì)肝球形表型和纖維化模型的影響，作者打印了不同比例的HepG2和HSC，每個(gè)球形有100個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)6天后，觀察到球體大小隨著HSC數(shù)量的增加而減小。隨著HSC數(shù)的進(jìn)一步增加，緊致度漸近，球體的形狀變得不規(guī)則。造血干細(xì)胞增加超過(guò)60%會(huì)導(dǎo)致非生理狀態(tài)和次優(yōu)球體。為了更深入地研究這一問(wèn)題，作者量化了球形膠原蛋白的生成，這是纖維化中的關(guān)鍵功能性生物標(biāo)志物。在50%以下，總膠原蛋白隨星狀細(xì)胞數(shù)量線性增加，每個(gè)星狀細(xì)胞產(chǎn)生的膠原蛋白數(shù)量大致不變（圖4）。

圖4 肝細(xì)胞微球細(xì)胞型比例的系統(tǒng)研究

使用細(xì)胞微球進(jìn)行藥物篩選時(shí)，其大小和功能的均勻性直接影響準(zhǔn)確性。由于µFCP可以制備均勻性的微球體，與隨機(jī)技術(shù)相比，它可以提供更精確的篩選。為了評(píng)估藥物反應(yīng)的可變性，我們使用TGF-β1促纖維化化合物處理微球，這是一種有效的星狀細(xì)胞激活刺激方式，導(dǎo)致I型膠原的產(chǎn)生。為了比較功能均勻性，我們通過(guò)計(jì)算I型膠原的面積來(lái)量化I型膠原的數(shù)量。實(shí)驗(yàn)表明，TGF-β1顯著增加了打印的球狀體和隨機(jī)生成的球狀體中的I型膠原，與隨機(jī)生成的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差測(cè)量相比，打印出來(lái)的球體導(dǎo)致測(cè)量變異性降低，測(cè)量可變性大大增加了藥物影響的統(tǒng)計(jì)顯著性（圖5）。

圖5 單細(xì)胞打印肝細(xì)胞微球利于準(zhǔn)確的體外藥效評(píng)價(jià)

基于隨機(jī)聚集所產(chǎn)生的肝細(xì)胞微球具有可變的尺寸和功能的缺點(diǎn)，限制了它們?cè)佻F(xiàn)肝臟生物學(xué)和纖維化的可重復(fù)性，以及使用它們作為組織模型進(jìn)行藥物篩選的準(zhǔn)確性。本文所提出的微流控單細(xì)胞打印方法克服了這些問(wèn)題，肝細(xì)胞微球是由所需精確數(shù)量的細(xì)胞類型和高活力的細(xì)胞組成。將多路復(fù)用技術(shù)與單細(xì)胞精度相結(jié)合，可以精確地制作出設(shè)計(jì)復(fù)雜度更高的細(xì)胞微球，這將有助于研究如何控制細(xì)胞微球的性質(zhì)或引入新的功能特性。

文章來(lái)源：
https://doi.org/10.1088/1758-5090/ac8622