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微流控流式細胞打印技術,制備功能性肝細胞微球

3D打印前沿
2022
09/02
10:08
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來源 : EngineeringForLife  


三維培養(yǎng)的多細胞肝臟微球模型有利于肝纖維化治療的發(fā)展。雖然這些模型可以再現(xiàn)纖維化疾病,但目前通過隨機聚集產(chǎn)生微球方法是不受控制的,較易產(chǎn)生大小、功能和效用不穩(wěn)定的球體。生物3D打印可以建立自動化成型,簡化過程和增加可靠性。然而,艙室的加載仍然是隨機的,產(chǎn)生了不均勻的組成和功能性質(zhì)的微球。這種可變性降低了使用微球進行篩選的準確性和靈敏度。

為了實現(xiàn)卓越的體外肝臟建模,需要建立新的方法來創(chuàng)建具有可控結(jié)構(gòu)、成分和功能特性的微球。近日,來自美國加利福尼亞大學的Adam R Abate團隊利用微流控流式細胞打印技術(µFCP)成功制造了精密肝臟細胞微球。所產(chǎn)生的細胞球體具有優(yōu)越的功能均勻性,與隨機生成的球體相比,具有更準確的統(tǒng)計窗口。相關研究以“Controlled fabrication of functional liver spheroids with microfluidic flow cytometric printing”為題于2022年8月2日在線發(fā)表在Biofabrication上。


圖1 微流控流式細胞打印技術產(chǎn)生肝細胞微球示意圖

首先,作者將肝細胞(HepG2)細胞經(jīng)胰蛋白酶處理后,通過26G針三次,使細胞團塊斷裂,制成單個HepG2細胞懸液。同樣,肝星狀細胞(HSC)也經(jīng)胰酶和EDTA消化為單細胞懸液;谖⒘骺匦酒_發(fā)的單細胞打印機可通過定制的LabVIEW界面實現(xiàn)自動化。作者采用康寧的6孔或384孔的圓底超低粘附微孔板作為印刷或被動加載基板。利用懸浮細胞制備細胞微球的一個挑戰(zhàn)是,不是所有的細胞都是活的。因此,使用隨機分隔技術,死亡的細胞包含在種子中,引入可以改變球形性質(zhì)的可變性。用活性染料可以丟棄死細胞,這是一種獨特而有價值的特性(圖2)。


圖2 與隨機沉淀法相比,產(chǎn)生的細胞存活率和均勻度更高

球形大小由培養(yǎng)時間和種子中起始細胞的數(shù)量決定。為了說明µFCP在控制球體大小方面的效用,作者打印出具有不同細胞數(shù)量的種子,并監(jiān)測它們的生長,與隨機加載相比,最終的大小變異性要小約3倍。為了說明準確控制其成分的能力,我們使用兩種方法構(gòu)建了含有10個HepG2和10個造血干細胞的目標成分的球體。對于µFCP, HepG2細胞平均10.4個,HSC細胞平均10.1個,標準誤差分別為0.9和0.8。對于隨機加載,根據(jù)泊松分布,我們觀察到HepG2細胞平均數(shù)量為9.4,HSC細胞平均數(shù)量為9.9,標準誤差分別為3.4和3.6。因此,印刷的球體比隨機加載產(chǎn)生的球體尺寸變異性低三倍。


圖3 采用微流控單細胞打印技術制備多細胞肝球,得到更加均勻的多細胞肝臟微球

纖維形成依賴于肝細胞與造血干細胞的相互作用。因此,這些細胞的比例變化可導致不規(guī)則的球形功能。為了研究細胞比例對肝球形表型和纖維化模型的影響,作者打印了不同比例的HepG2和HSC,每個球形有100個細胞。培養(yǎng)6天后,觀察到球體大小隨著HSC數(shù)量的增加而減小。隨著HSC數(shù)的進一步增加,緊致度漸近,球體的形狀變得不規(guī)則。造血干細胞增加超過60%會導致非生理狀態(tài)和次優(yōu)球體。為了更深入地研究這一問題,作者量化了球形膠原蛋白的生成,這是纖維化中的關鍵功能性生物標志物。在50%以下,總膠原蛋白隨星狀細胞數(shù)量線性增加,每個星狀細胞產(chǎn)生的膠原蛋白數(shù)量大致不變(圖4)。


圖4 肝細胞微球細胞型比例的系統(tǒng)研究

使用細胞微球進行藥物篩選時,其大小和功能的均勻性直接影響準確性。由于µFCP可以制備均勻性的微球體,與隨機技術相比,它可以提供更精確的篩選。為了評估藥物反應的可變性,我們使用TGF-β1促纖維化化合物處理微球,這是一種有效的星狀細胞激活刺激方式,導致I型膠原的產(chǎn)生。為了比較功能均勻性,我們通過計算I型膠原的面積來量化I型膠原的數(shù)量。實驗表明,TGF-β1顯著增加了打印的球狀體和隨機生成的球狀體中的I型膠原,與隨機生成的相對標準誤差測量相比,打印出來的球體導致測量變異性降低,測量可變性大大增加了藥物影響的統(tǒng)計顯著性(圖5)。


圖5 單細胞打印肝細胞微球利于準確的體外藥效評價

基于隨機聚集所產(chǎn)生的肝細胞微球具有可變的尺寸和功能的缺點,限制了它們再現(xiàn)肝臟生物學和纖維化的可重復性,以及使用它們作為組織模型進行藥物篩選的準確性。本文所提出的微流控單細胞打印方法克服了這些問題,肝細胞微球是由所需精確數(shù)量的細胞類型和高活力的細胞組成。將多路復用技術與單細胞精度相結(jié)合,可以精確地制作出設計復雜度更高的細胞微球,這將有助于研究如何控制細胞微球的性質(zhì)或引入新的功能特性。

文章來源:
https://doi.org/10.1088/1758-5090/ac8622

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