浙大楊華勇院士團隊 | 多工藝多材料同步新型生物3D打印方法

來源：生物設計與制造


本文來自本刊主編浙江大學機械工程學院楊華勇院士團隊，介紹了一種可實現(xiàn)多工藝多材料同步構建的新型生物3D打印方法，該方法可以支持多種生物材料的同步沉積打印。本研究提出的多材料生物制造方法非常靈活，可適用于基于天然生物材料、合成生物材料、細胞聚集體或復合材料的生物墨水，并能準確復現(xiàn)異質組織的復雜組成。模塊化的噴頭設計增加了組合打印方法的靈活性，可以將擠出式、噴墨式、光固化式、靜電紡絲等多種打印技術融合到打印過程中，也可根據制造精度或所選生物材料的要求進行個性化定制。利用上述功能完備的混合生物3D打印系統(tǒng)，可以實現(xiàn)在同一打印平臺上構建無法用單一工藝打印的復雜異質組織或器官。

生物3D打�。河行�構建仿生組織和器官的技術
生物3D打印是生物制造領域的一項重要技術，旨在創(chuàng)建功能性仿生結構。靈活自由、豐富多樣且功能全面的生物3D打印技術通過將細胞、生物材料或生長因子組裝成生物墨水來制造復雜的生物結構[1,2]。傳統(tǒng)的生物3D打印技術現(xiàn)在面臨著諸多挑戰(zhàn)，包括打印水凝膠結構整體機械穩(wěn)定性與構建體的生物微環(huán)境仿生程度和打印組織/器官的血管化等問題�？蒲腥藛T已經普遍意識到，僅用單一材料構建功能齊全的組織/器官是不現(xiàn)實的。天然組織器官的復雜生物材料組成和細胞多樣性，使得單一材料生物3D打印技術無法滿足其體外構建的需求[3]。

多材料生物3D打印
為解決當前遇到的困難，多材料生物3D打印是一種簡單明了的方法，能夠構建含多種材料與細胞的異質結構，可以更好地模擬天然組織/器官。對于目前最常見的生物3D打印方法，包括擠出、噴墨和光輔助打印，國際上各研究組已經進行了一些多材料打印的嘗試，業(yè)內著名學者美國Terasaki生物創(chuàng)新研究所的Ali Khademhosseini等人對此已經進行過總結和討論[4,5]。目前的多材料擠出打印和噴墨打印具有簡單直接和材料切換速度相當快的優(yōu)點，但它們限于生物墨水本身的流變學性質，對生物材料的選擇有所局限。光輔助技術分辨率高，但多種材料切換需要復雜的機制，花費相對較長的時間，并且適用的生物墨水需要在可能具有細胞毒性的光引發(fā)劑的輔助下才能交聯(lián)。在異質結構中整合具有不同性質的生物墨水仍然是生物3D打印功能化的組織/器官目前遇到的重要挑戰(zhàn)，亟需更先進的制造技術提供支撐。

多工藝融合打印
采用單一工藝進行生物制造很難突破各種生物墨水材料帶來的限制。為了充分發(fā)揮不同生物材料的特性，將多種打印工藝結合到一個裝備平臺上是有意義的。而且復雜異質組織器官具有宏-微-納復合拓撲結構，難以用一種打印手段對各級精細結構進行完美呈現(xiàn)，因此我們需要將多種生物3D打印手段結合起來進行制造，譬如集成擠出式打印的多重墨水適配性與噴墨式打印的精準性可以對細胞和生物材料的空間分布進行更好的調控�，F(xiàn)階段我們僅能找到很少的案例進行過此類嘗試，包括數字光處理（DLP）和擠出、擠出與靜電紡絲的組合[6,7]，而這對于體外制造活性組織是遠遠不夠的。

為何我們要嘗試多材料同步構建異質結構？
大多數多材料打印技術遇到的問題在于其很難在有限的時間（為保持生物材料活性）內對復雜異質組織進行有效構建。由于CAD建模、路徑規(guī)劃或裝備復雜度等各種挑戰(zhàn)，即使裝備了多個打印噴頭，現(xiàn)階段的打印設備也僅能做到同時打印多個重復結構，或進行序列式打印。我們認為，在采用增材制造方法，層層堆疊進行打印時，在同一層內的不同細胞等活性生物因子應同步進行打印。這不僅可以極大地縮短打印時間，提高組織活性，還能促進不同種材料之間的融合，提高所構建組織的整體機械性能。

模塊化設計的同步打印平臺
為了提高構建多層結構的打印效率，國內外的研究人員開發(fā)了一種兩個噴頭獨立控制的多軸笛卡爾系生物3D打印機和使用多個可以并行打印的六自由度（6-DOF）機器人構建的生物3D打印裝備[8,9]。雖然這些方法能夠使用兩個噴頭同時進行生物3D打印，但它們缺乏使用更多打印方法同時進行生物3D打印的能力。

為了解決當前存在的難題，本研究設計了一種基于多個噴頭獨立控制的生物3D打印方法，該方法可以支持多個噴頭的同時打印。模塊化設計增加了組合打印方法的靈活性，可以根據制造精度或所選生物材料的要求進行定制（如圖1所示）。本文提出的多材料生物制造方法非常靈活，適用于基于天然生物材料、合成生物材料、細胞聚集體或復合材料的生物墨水，并能準確再現(xiàn)異質組織的復雜組成。由于采用模塊化設計方法，同軸打印和嵌入式生物3D打印技術也可以輕松應用從而實現(xiàn)更復雜的人體組織/器官的構建。此外，還可以通過模塊化設計引入其他基于噴嘴的打印方式，如基于液滴的擠出、靜電紡絲等技術，以實現(xiàn)工藝融合的復合制造。

圖1 適用多材料(a)和多工藝(b)的生物3D打印混合制造系統(tǒng)示意圖

打印展示
利用上述功能強大的復合生物3D打印平臺，可以構建一些單一方法無法打印的復雜異質組織/器官。作為演示，使用所提出的基于多噴頭的多材料打印方法打印全層血管化皮膚補片模型和三層管狀類血管模型。如圖2a所示，設計的皮膚補片模型可以通過傳統(tǒng)擠出、同軸擠出、噴墨和基于光輔助的打印技術結合來制造。圖2ai-2aiv表示皮膚補片模型的真皮層、皮下血管、微血管層和表皮層的構建�？梢园l(fā)現(xiàn)，構建全層血管化皮膚補片模型所需的生物材料因層而異，而本文的多材料生物3D打印技術能夠在合理的短時間內準確復現(xiàn)實際皮膚組織模型。

為了更好地驗證本研究提出的方法在多層管狀生物組織構建中的優(yōu)勢，設計了一個直徑約800 µm的三層空心管模型（如圖2c所示）。三種不同的生物墨水分別用于構建內層、中間層和外層。如圖2d所示，基于多噴頭擠出的多材料生物3D打印技術構建的三層管狀模型貼合緊密，在共聚焦顯微鏡下，內外血管貼合良好，形態(tài)保持良好（圖2e）。

此外，本文對管狀模型進行了細胞培養(yǎng)，可以觀察到，在構建的模型中培養(yǎng)四天后，平滑肌細胞MOVAS保持高度活性（圖2f）。共聚焦顯微鏡顯示MOVAS可以均勻分布在管狀模型的表面。在高倍鏡下，這些細胞彼此緊密連接，形成肌肉細胞層（圖2g），這表明本研究的同步多材料生物3D打印方法擁有創(chuàng)建具有高細胞活性的多層復雜結構的能力。

圖2 多材料異質生物組織的構建: (a) 基于多噴嘴技術構建的多層血管化皮膚補片模型的打印過程；(b) 打印生成的皮膚補片模型；(c) 三層管狀模型及其生物材料分布示意圖；(d) 顯微鏡下觀察的三層管狀模型（di），三層管狀模型的熒光粒子分布（dii）；(e) 共焦顯微鏡下觀察熒光粒子在管狀模型內外層的分布；(f) 第四天平滑肌細胞MOVAS活/死染色；(g) 含平滑肌細胞MOVAS的局部血管模型三維共聚焦圖像（gi），高倍鏡下觀察到的MOVAS細胞（gii）

未來展望
隨著新打印技術的發(fā)展，多材料生物3D打印技術正在不斷發(fā)展中。在現(xiàn)有生物3D打印方法的基礎上，通過重新設計、多功能設備結合組裝從而形成擁有新的功能的復合打印技術。該技術還可以隨著打印技術的發(fā)展，根據需要更換打印單元。目前，人體組織構建的制造技術已經有兩種組合，一種是基于擠出和噴墨技術的復合制造方法用于皮膚打印，另一種是基于光固化和擠出的復合制造技術，用于構建含細胞的水凝膠結構�？梢灶A見，在未來的多材料生物3D打印領域，微擠壓、噴墨、立體光刻和基于微流控的生物3D打印等多種工藝的復合制造將是主要趨勢之一。

除了過程中的復合制造，多材料生物3D打印技術還可以通過使用更先進的材料來得到進一步發(fā)展，利用自組裝材料實現(xiàn)含細胞精細微結構或生物特異性組織。研究表明，使用自愈性懸浮液可以更自由地在液體中構建復雜結構。此外，多材料生物3D打印可以通過犧牲墨水材料、實現(xiàn)多層管狀血管的構建，以及引入刺激響應材料作為生物墨水來實現(xiàn)4D打印在生物制造中的集成，從而改進當前的單一材料設計。

我們相信，通過這種復雜的同步多材料多工藝生物3D打印，最終可以以相對較高的打印效率，打印出含有不同組分細胞和精細微觀結構的全功能異質組織/器官，從而實現(xiàn)用于組織/器官移植的目標。