Materials today advances|利用SUNP BP11低溫沉積3D打印構(gòu)建促血管化骨再生的多機(jī)...

骨組織工程已經(jīng)發(fā)展多年，但骨支架仍存在一些缺陷導(dǎo)致其未能進(jìn)入臨床使用，主要包括難以與周?chē)�組織整合，生物活性差。已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在組織工程支架中構(gòu)建藥物遞送體系可以實(shí)現(xiàn)多種功能，有望解決這些缺陷。近日，一篇名為“3D-printed scaffold with halloysite nanotubes laden as a sequential drug delivery system regulates vascularized bone tissue healing”的文章由清華大學(xué)的孫偉教授研究團(tuán)隊(duì)在Materials today advances (IF=7.579)上發(fā)表。該研究展示了一種低溫沉積制造的復(fù)合不同機(jī)制藥物控釋支架，能夠適配于體內(nèi)先成血管再成骨的生理進(jìn)程，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)中均取得了良好效果。

背景介紹

現(xiàn)已有部分載藥支架致力于營(yíng)造支架內(nèi)部血管化環(huán)境增強(qiáng)骨誘導(dǎo)性并促進(jìn)其與周?chē)�組織整合。但是取得效果不理想，原因有二：首先，如果支架只能單純地將促血管化藥物與促骨再生藥物以相同方式加載并做長(zhǎng)期釋放，可能導(dǎo)致最后相比于只基于骨發(fā)生刺激的組別骨再生骨量更低，此外，一些依賴(lài)于核殼結(jié)構(gòu)釋放兩種藥物的水凝膠材料力學(xué)強(qiáng)度差易變形，且內(nèi)部無(wú)多孔結(jié)構(gòu)，修復(fù)中期可能相對(duì)于周?chē)�組織更類(lèi)似于異物植入。

為了解決上述問(wèn)題，該研究擬采用在支架中復(fù)合不同遞送機(jī)制的方法。依賴(lài)于不同機(jī)制的藥物釋放在突釋量-半衰期圖表中占據(jù)不同的區(qū)域，也就意味著不同遞送機(jī)制的平均釋放時(shí)長(zhǎng)有較大的差異。而在組織修復(fù)的過(guò)程，往往不是單一因子直接作用全程的過(guò)程，而是需要多個(gè)階段相互協(xié)調(diào)，依次進(jìn)行。所以這兩者在時(shí)域上是可以良好匹配的，作用于修復(fù)前期的因子可以選擇半衰期較短的遞送系統(tǒng)，例如單純擴(kuò)散，靜電相互作用等，而作用于修復(fù)后期的因子可以選擇半衰期較長(zhǎng)的遞送體系，例如降解，側(cè)鏈斷裂等。

該研究中的支架針對(duì)于骨修復(fù)中血管生成和骨發(fā)生的生物學(xué)過(guò)程，其生理進(jìn)程順序?yàn)橄瘸裳�管再成骨。選擇埃洛石納米管通過(guò)靜電相互作用負(fù)載與釋放促血管生成藥物去鐵胺（DFO），這一過(guò)程理論上會(huì)在較短時(shí)間內(nèi)完成，避免長(zhǎng)期釋放帶來(lái)的骨量下降的問(wèn)題，選擇殼聚糖微球包裹骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP2，通過(guò)材料降解釋放，這一過(guò)程將適配于時(shí)間較長(zhǎng)的整個(gè)骨修復(fù)階段。研究路線(xiàn)如圖所示，實(shí)驗(yàn)組將兩種載藥顆�；旌嫌诠侵Ъ芑�體材料PLGA-TCP體系中分散并通過(guò)不損害藥物活性的SUNP BP11低溫沉積3D打印機(jī)制成含多級(jí)孔隙結(jié)構(gòu)，另外包括不含藥物支架，只含促血管藥物支架和只含促骨再生藥物支架作為對(duì)比。最后通過(guò)體外和體內(nèi)生物實(shí)驗(yàn)評(píng)估支架的促血管化能力和骨誘導(dǎo)性。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程與結(jié)果

1. 載藥支架理化性質(zhì)表征

支架的總體結(jié)構(gòu)如圖所示，通過(guò)掃描電鏡觀(guān)察內(nèi)部形態(tài)可以觀(guān)察到兩種載藥顆粒且均勻的分布于支架內(nèi)部。值得一提的是，納米顆粒的加載可以大幅提高支架的壓縮強(qiáng)度，使其與松質(zhì)骨的平均壓縮強(qiáng)度相近。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)支架具有較好的多級(jí)孔隙結(jié)構(gòu)，宏觀(guān)孔有利于組織更好的長(zhǎng)入，而微觀(guān)孔則滿(mǎn)足了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳送和藥物從支架內(nèi)釋放的要求。釋放動(dòng)力學(xué)顯示，實(shí)驗(yàn)組組支架可以匹配骨修復(fù)的不同階段進(jìn)程，在前期一周內(nèi)可以促進(jìn)血管生成，在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)三周內(nèi)可以持續(xù)釋放BMP2促進(jìn)骨組織再生。這與真實(shí)條件下的骨再生進(jìn)程是相吻合的。

圖2. (a)低溫沉積打印支架的實(shí)物照片；(b)加載BMP2的殼聚糖微球；(b)加載DFO的納米埃洛石；

(d)宏觀(guān)尺度的支架形貌和(e)不同支架組中的微觀(guān)結(jié)構(gòu)；(f)不同組支架的抗壓強(qiáng)度。

2. 體外實(shí)驗(yàn)-生物相容性驗(yàn)證

細(xì)胞活死染色和相對(duì)增殖率測(cè)試表面載藥支架生物相容性好。且細(xì)胞骨架染色結(jié)果顯示在含有促血管生成藥物和促成骨藥物的支架中，細(xì)胞伸展情況更為良好。

圖3. (a)骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs的活/死染色；(b)第1天和第7天利用CCK8測(cè)定細(xì)胞增殖；

(c)第7天不同組別MSCs的細(xì)胞骨架染色。

3. 體外實(shí)驗(yàn)-驗(yàn)證間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化

骨鈣素在調(diào)節(jié)骨鈣代謝中起重要作用，是研究骨代謝的生化標(biāo)志物。對(duì)骨鈣素進(jìn)行免疫熒光染色，載BMP2支架中細(xì)胞骨鈣素表達(dá)水平更高，意味著更多的骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞在支架的調(diào)控下向著成骨的方向靠近。而加入內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)在載DFO支架上生長(zhǎng)更為良好，具體表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞間形成緊密的細(xì)胞連接且具有較大的覆蓋面積并更好地形成緊密的粘附連接，。相關(guān)基因表達(dá)的測(cè)試與特征蛋白表達(dá)的結(jié)果互為印證。

圖4. (a)MSCs 的骨鈣素免疫熒光染色；(b)共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，MSCs 的骨鈣素表達(dá)(紅色)和HUVECs 的 CD31 (綠色) 的免疫熒光染色；

(c)BMSCs 在不同支架上接種后的堿性磷酸酶活性；(d)培養(yǎng)7天后成骨分化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)，包括OCN、Runx2、Osterix、OPN、Col1a。

4. 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)-體內(nèi)相容性分析

為了論證載藥支架在體內(nèi)培養(yǎng)條件下同樣可以發(fā)揮功能，誘導(dǎo)血管生成并加速骨修復(fù)，該研究同時(shí)進(jìn)行了大鼠皮下包埋異位成骨實(shí)驗(yàn)�？梢钥吹捷d藥支架與周?chē)�組織整合良好，周?chē)�組織完成了長(zhǎng)入的行為，植入處的組織發(fā)生較為明顯的血管生成，附著組織更為厚實(shí)。通過(guò)HE染色觀(guān)察支架與周?chē)�組織的整合，可以看出，組織可以良好的長(zhǎng)入到支架內(nèi)部，在實(shí)驗(yàn)組中有大量類(lèi)骨樣組織的形成。利用免疫標(biāo)志物的特征染色證明了遞送體系的加入并不會(huì)引起額外的炎癥反應(yīng)。

圖5. (a) 新組織-細(xì)胞結(jié)合物-實(shí)物照片；(b) 新生組織的蘇木精-伊紅 (HE) 染色；

(c) 不同組支架的CD206（M2 極化巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，綠色）和 INOS（M1 極化巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，紅色）的免疫熒光染色圖像

5. 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)-組織學(xué)分析

通過(guò)CD31免疫組化染色結(jié)果看出，在支架釋放藥物調(diào)控的作用下，血管數(shù)量和質(zhì)量有明顯提升。通過(guò)MASSON染色觀(guān)察I型膠原生成量，更多的膠原生成和沉積表明兩種藥物的聯(lián)合作用實(shí)現(xiàn)更好的促成骨效果。利用茜素紅進(jìn)行鈣鹽染色，可以發(fā)現(xiàn)在載藥支架的調(diào)控作用下，支架內(nèi)鈣的生成和沉積更為明顯且有更多的鈣結(jié)節(jié)形成。

圖6. (a) CD31 免疫組化染色顯示血管生成情況；(b) Masson三色染色顯示膠原數(shù)量；(c) 茜素紅染色顯示鈣沉積和鈣化結(jié)節(jié)形成

結(jié)論

針對(duì)于現(xiàn)有支架難以與骨修復(fù)多階段生理進(jìn)程兼容的現(xiàn)狀，研究建立了復(fù)合靜電相互作用和基質(zhì)材料降解的多機(jī)制控釋體系，并結(jié)合3D打印制造技術(shù)完成多種藥物的功能性加載，成功構(gòu)建了具有多級(jí)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的仿生組織工程支架。該支架具有時(shí)序性遞送功能，保證促成血管藥物去鐵胺168小時(shí)內(nèi)完成快速釋放，以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白在超過(guò)600小時(shí)的較長(zhǎng)時(shí)間段內(nèi)持續(xù)給藥，達(dá)到對(duì)體內(nèi)骨修復(fù)過(guò)程中血腫、成骨等復(fù)雜多階段進(jìn)程所需生化環(huán)境條件的適配。大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，支架在3周內(nèi)成功實(shí)現(xiàn)血管化骨組織替代物的誘導(dǎo)生成，相比未配備藥物緩釋體系的普通支架，獲得 2倍以上新生血管數(shù)、3倍以上礦化膠原沉積量，有效促進(jìn)骨修復(fù)的效率和質(zhì)量。該種復(fù)合不同機(jī)制的時(shí)序遞送系統(tǒng)有望應(yīng)用于臨床中大段骨缺損的治療。

參考文獻(xiàn)

J. Ji, C. Wang, Z. Xiong, Y. Pang, W. Sun, 3D-printed scaffold with halloysite nanotubes laden as a sequential drug delivery system regulates vascularized bone tissue healing, Mater. Today Adv. 15 (2022) 100259. https://doi.org/10.1016/j.mtadv.2022.100259.