基于液滴生物打印制造細(xì)胞-水凝膠-微纖維復(fù)合組織前體

來源：生物設(shè)計(jì)與制造


本研究論文聚焦多液滴融合打印的技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用實(shí)例。復(fù)合材料能結(jié)合各組分材料優(yōu)勢(shì)實(shí)現(xiàn)獨(dú)特的材料性能，在許多組織工程應(yīng)用中具有特殊價(jià)值。將水凝膠和纖維支架相結(jié)合可以增強(qiáng)組織結(jié)構(gòu)的生物和結(jié)構(gòu)功能性，但開發(fā)有效且可擴(kuò)展的方法用于制造此類復(fù)合材料存在挑戰(zhàn)。本工作使用一種基于液滴的生物打印系統(tǒng) (reactive jet impingement, ReJI) 將載細(xì)胞水凝膠與微纖維網(wǎng)絡(luò)支架集成在一起。該打印系統(tǒng)的兩個(gè)微閥式噴嘴分別連接至不同的生物墨水墨盒，產(chǎn)生對(duì)應(yīng)墨水的液滴，液滴在空中碰撞融合后發(fā)生交聯(lián)形成水凝膠，最后沉積至微纖維網(wǎng)上。

以膠原蛋白-海藻酸鈉-纖維蛋白水凝膠基質(zhì)包裹兩種不同濃度（5×106和30×106 cells/ml）的人真皮成纖維細(xì)胞作為生物墨水，生物打印到微纖維網(wǎng)絡(luò)基底上制備出細(xì)胞-水凝膠-纖維復(fù)合材料。結(jié)果表明，這兩種類型的細(xì)胞-水凝膠-微纖維復(fù)合材料保持了較高的細(xì)胞活性，并促進(jìn)了細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-生物材料相互作用。較低的成纖維細(xì)胞密度引發(fā)細(xì)胞增殖，而較高的成纖維細(xì)胞密度有助于細(xì)胞更快地組織和滲透到微纖維中。

此外，復(fù)合材料的纖維成分具有高溶脹和快速釋放鈣離子的特性。本工作制造的復(fù)合結(jié)構(gòu)為薄片狀組織工程提供了一種制造高度功能性支架的方法，特別是傷口愈合和皮膚組織工程應(yīng)用。

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圖1 基于液滴的生物打印設(shè)置。(a) 打印系統(tǒng)示意圖。安裝在定制打印頭中的微閥噴嘴噴射生物墨水，打印頭安裝在商用JetLab 4 XL 打印機(jī)上。微閥噴嘴連接至不同的生物墨水墨盒，并在半空中相互噴射生物墨水液滴，液滴碰撞后交聯(lián)形成凝膠，沉積在基底上。每個(gè)微閥噴嘴連接到驅(qū)動(dòng)器上，控制微閥的打開和關(guān)閉，同時(shí)還連接到氣壓控制系統(tǒng)和打印機(jī)輸入。(b) 打印系統(tǒng)組成：(1)生物墨水墨盒；(2)打印平臺(tái)；(3)打印頭和微閥噴嘴；(4)細(xì)胞攪拌系統(tǒng)；(5)壓力調(diào)節(jié)系統(tǒng)。(c) 安裝兩個(gè)微閥噴嘴的打印頭

圖2 (a) 海藻酸鈣衰減全反射傅里葉變換紅外光譜；(b) 海藻酸鈣纖維網(wǎng)SEM圖，標(biāo)尺200 μm；(c) 海藻酸鈣纖維網(wǎng)在DPBS中溶脹；(d) 海藻酸鈣纖維網(wǎng)釋放到DPBS中鈣離子濃度

圖3 (a) 復(fù)合結(jié)構(gòu)SEM顯微照片，細(xì)胞負(fù)載水凝膠直接打印在纖維網(wǎng)上，白色正方形表示圖3b中的活/死圖像的大致區(qū)域；(b) 以5 M cells/ml和30 M cells/ml細(xì)胞密度打印在微纖維網(wǎng)上的Neo-NHDF細(xì)胞在第1、3、7天活死染色。綠色表示活細(xì)胞，紅色表示死細(xì)胞。標(biāo)尺: a 1 mm, b 500 μm

圖4 打印在蓋玻片或微纖維網(wǎng)上的包裹在水凝膠中的Neo-NHDF細(xì)胞代謝活性，細(xì)胞密度: (a) 5 M cells/mL和(b) 30 M cells/mL；(c) 細(xì)胞-水凝膠-微纖維結(jié)構(gòu)中Neo-NHDF細(xì)胞含量；(d) 打印在微纖維網(wǎng)上Neo-NHDF細(xì)胞代謝活性

圖5 在第0、1、3、7天共聚焦觀察打印在微纖維網(wǎng)上由水凝膠包裹的Neo-NHDF細(xì)胞，細(xì)胞密度為 5 M cells/mL 和30 M cells/mL。藍(lán)色、紅色和綠色染色分別顯示細(xì)胞核、肌動(dòng)蛋白和紐帶蛋白。白線表示富含細(xì)胞的水凝膠組織受到纖維的影響。比例尺：100μm

圖6 第1和3天Neo-NHDF細(xì)胞組織，細(xì)胞密度: (a) 5 M cells/mL 和 (b) 30 M cells/mL；在第0、1、3、7天共聚焦觀察打印在微纖維網(wǎng)上由水凝膠包裹的Neo-NHDF細(xì)胞，細(xì)胞密度: (c) 5 M cells/mL 和 (d) 30 M cells/mL。藍(lán)色、紅色和綠色染色分別顯示細(xì)胞核、肌動(dòng)蛋白和紐帶蛋白。比例尺：a, b 100μm；c, d 50μm

圖7 細(xì)胞-凝膠-微纖維復(fù)合結(jié)構(gòu)第1、3、7天SEM顯微照片，細(xì)胞密度為 5 M cells/mL 和30 M cells/mL。紅星和綠星分別表示細(xì)胞/細(xì)胞層和生物打印的膠原蛋白/海藻酸鈉/纖維蛋白 (CAF)基質(zhì)。第7天形成致密細(xì)胞，很難區(qū)分細(xì)胞和水凝膠基質(zhì)。比例尺：200μm

圖8 (a)復(fù)合結(jié)構(gòu)的SEM顯微照片顯示5 M cells/mL 和30 M cells/mL neo-NHDF細(xì)胞的ECM沉積物，紅星和藍(lán)星分別表示細(xì)胞和ECM沉積物；(b) 培養(yǎng)21天后復(fù)合結(jié)構(gòu)的H&E染色顯示了細(xì)胞滲透、增殖和ECM產(chǎn)生。黑星表示交聯(lián)的膠原蛋白/海藻酸鈉/纖維蛋白 (CAF) 基質(zhì)在第1天被染成亮粉色，橙色星表示結(jié)構(gòu)內(nèi)存在纖維/空洞。比例尺：a 20μm；b 200μm