基于液滴生物打印制造細胞-水凝膠-微纖維復合組織前體

來源：生物設計與制造


本研究論文聚焦多液滴融合打印的技術創(chuàng)新與應用實例。復合材料能結合各組分材料優(yōu)勢實現(xiàn)獨特的材料性能，在許多組織工程應用中具有特殊價值。將水凝膠和纖維支架相結合可以增強組織結構的生物和結構功能性，但開發(fā)有效且可擴展的方法用于制造此類復合材料存在挑戰(zhàn)。本工作使用一種基于液滴的生物打印系統(tǒng) (reactive jet impingement, ReJI) 將載細胞水凝膠與微纖維網(wǎng)絡支架集成在一起。該打印系統(tǒng)的兩個微閥式噴嘴分別連接至不同的生物墨水墨盒，產(chǎn)生對應墨水的液滴，液滴在空中碰撞融合后發(fā)生交聯(lián)形成水凝膠，最后沉積至微纖維網(wǎng)上。

以膠原蛋白-海藻酸鈉-纖維蛋白水凝膠基質(zhì)包裹兩種不同濃度（5×106和30×106 cells/ml）的人真皮成纖維細胞作為生物墨水，生物打印到微纖維網(wǎng)絡基底上制備出細胞-水凝膠-纖維復合材料。結果表明，這兩種類型的細胞-水凝膠-微纖維復合材料保持了較高的細胞活性，并促進了細胞-細胞和細胞-生物材料相互作用。較低的成纖維細胞密度引發(fā)細胞增殖，而較高的成纖維細胞密度有助于細胞更快地組織和滲透到微纖維中。

此外，復合材料的纖維成分具有高溶脹和快速釋放鈣離子的特性。本工作制造的復合結構為薄片狀組織工程提供了一種制造高度功能性支架的方法，特別是傷口愈合和皮膚組織工程應用。

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圖1 基于液滴的生物打印設置。(a) 打印系統(tǒng)示意圖。安裝在定制打印頭中的微閥噴嘴噴射生物墨水，打印頭安裝在商用JetLab 4 XL 打印機上。微閥噴嘴連接至不同的生物墨水墨盒，并在半空中相互噴射生物墨水液滴，液滴碰撞后交聯(lián)形成凝膠，沉積在基底上。每個微閥噴嘴連接到驅(qū)動器上，控制微閥的打開和關閉，同時還連接到氣壓控制系統(tǒng)和打印機輸入。(b) 打印系統(tǒng)組成：(1)生物墨水墨盒；(2)打印平臺；(3)打印頭和微閥噴嘴；(4)細胞攪拌系統(tǒng)；(5)壓力調(diào)節(jié)系統(tǒng)。(c) 安裝兩個微閥噴嘴的打印頭

圖2 (a) 海藻酸鈣衰減全反射傅里葉變換紅外光譜；(b) 海藻酸鈣纖維網(wǎng)SEM圖，標尺200 μm；(c) 海藻酸鈣纖維網(wǎng)在DPBS中溶脹；(d) 海藻酸鈣纖維網(wǎng)釋放到DPBS中鈣離子濃度

圖3 (a) 復合結構SEM顯微照片，細胞負載水凝膠直接打印在纖維網(wǎng)上，白色正方形表示圖3b中的活/死圖像的大致區(qū)域；(b) 以5 M cells/ml和30 M cells/ml細胞密度打印在微纖維網(wǎng)上的Neo-NHDF細胞在第1、3、7天活死染色。綠色表示活細胞，紅色表示死細胞。標尺: a 1 mm, b 500 μm

圖4 打印在蓋玻片或微纖維網(wǎng)上的包裹在水凝膠中的Neo-NHDF細胞代謝活性，細胞密度: (a) 5 M cells/mL和(b) 30 M cells/mL；(c) 細胞-水凝膠-微纖維結構中Neo-NHDF細胞含量；(d) 打印在微纖維網(wǎng)上Neo-NHDF細胞代謝活性

圖5 在第0、1、3、7天共聚焦觀察打印在微纖維網(wǎng)上由水凝膠包裹的Neo-NHDF細胞，細胞密度為 5 M cells/mL 和30 M cells/mL。藍色、紅色和綠色染色分別顯示細胞核、肌動蛋白和紐帶蛋白。白線表示富含細胞的水凝膠組織受到纖維的影響。比例尺：100μm

圖6 第1和3天Neo-NHDF細胞組織，細胞密度: (a) 5 M cells/mL 和 (b) 30 M cells/mL；在第0、1、3、7天共聚焦觀察打印在微纖維網(wǎng)上由水凝膠包裹的Neo-NHDF細胞，細胞密度: (c) 5 M cells/mL 和 (d) 30 M cells/mL。藍色、紅色和綠色染色分別顯示細胞核、肌動蛋白和紐帶蛋白。比例尺：a, b 100μm；c, d 50μm

圖7 細胞-凝膠-微纖維復合結構第1、3、7天SEM顯微照片，細胞密度為 5 M cells/mL 和30 M cells/mL。紅星和綠星分別表示細胞/細胞層和生物打印的膠原蛋白/海藻酸鈉/纖維蛋白 (CAF)基質(zhì)。第7天形成致密細胞，很難區(qū)分細胞和水凝膠基質(zhì)。比例尺：200μm

圖8 (a)復合結構的SEM顯微照片顯示5 M cells/mL 和30 M cells/mL neo-NHDF細胞的ECM沉積物，紅星和藍星分別表示細胞和ECM沉積物；(b) 培養(yǎng)21天后復合結構的H&E染色顯示了細胞滲透、增殖和ECM產(chǎn)生。黑星表示交聯(lián)的膠原蛋白/海藻酸鈉/纖維蛋白 (CAF) 基質(zhì)在第1天被染成亮粉色，橙色星表示結構內(nèi)存在纖維/空洞。比例尺：a 20μm；b 200μm