生物活性與抗菌功能涂層的3D打印高密度聚乙烯耳廓支架用于耳廓重建

來源： EngineeringForLife


多孔高密度聚乙烯（HDPE，Medpor®）是臨床上最常用的耳廓重建植入材料之一，但由于其物理和化學性質(zhì)（如剛性、疏水性和生物惰性等），常常會導致術后并發(fā)癥，如炎癥、感染、移位和擠壓。此外，由于商品耳廓HDPE支架難以個性化生產(chǎn)，通常情況下術前須由外科醫(yī)生通過手工雕刻、修剪來調(diào)整形狀，以確保患者耳廓外形合適。

基于此，南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院黃文華、吳耀彬團隊開發(fā)了一種具有生物活性和抗菌LBL（Layer-by-layer）涂層，用以修飾具有個性化外觀的3D打印HDPE耳廓支架，以改善術中雕刻困難問題，降低術后并發(fā)癥的發(fā)生率（圖1）。相關工作以“3D-printed high-density polyethylene scaffolds with bioactive and antibacterial layer-by-layer modification for auricle reconstruction”為題發(fā)表在“Materials Today Bio”

圖1 HDPE涂層耳廓支架的制備示意圖

首先利用擠出試熔融3D打印技術制備多孔HDPE支架，隨后進行pDA涂層活化，并被EPL和FIB逐層包裹。所制備的耳廓支架具有生物活性、抗菌、促進血管生成和促進皮膚組織生長的特性。

圖2 pDA-、EPL-和FIB修飾3D打印HDPE支架的表征。(a)不同線徑的HDPE支架制備示意圖；(b) HDPE支架纖維直徑隨速度和壓力參數(shù)變化的光學顯微圖像；(c) HDPE支架長絲直徑定量分析；(d) pDA、EPL和FIB的涂層機理示意圖；HDPE (e, f, g)、pDA (h, i, j)和pDA-EFE (k, l, m)支架的實物照片和相應的SEM圖像

本研究，首先通過對擠出試3D打印的各項參數(shù)調(diào)整（如氣壓、針頭、速度等），從而得到比較穩(wěn)定孔徑、線徑的HDPE支架。隨后，通過多巴胺（DA）自聚合作用，將聚多巴胺（pDA）涂附在HDPE表面，使其表面具有一定的生物活性，且具備一個“二級平臺”的功能，并能進一步地粘附其它的功能涂層。pDA與具有抗菌功能的EPL（ε-polylysine）之間可以通過共價結合等方式，將EPL粘附在支架表面。而EPL攜帶大量的正電，可與FIB（Fibrin）所攜帶的負電進行電荷吸附，從而使得LBL活性功能涂層能夠很好地粘附在支架表面（圖2）。

圖3 L929細胞在支架表面形態(tài)。L929細胞在HDPE (a, d)、pDA (b, e)和pDA- EFE (c, f)支架上用F-actin(綠色)和DAPI(藍色)染色的共聚焦熒光顯微鏡圖像的俯視圖和3D視圖。L929細胞分布在HDPE (g)、pDA (h)和pDA- efe (i)支架上的SEM圖像。(j) L929細胞在支架上的分布示意圖。(k)定量分析支架最上層和最下層的L929細胞數(shù)量。(l)支架頂層細胞間隙定量分析。(m)測量細胞縱橫比的細胞伸長方案。(n) L929細胞在HDPE、pDA和pDA-EFE支架上的細胞長徑比統(tǒng)計分析

進一步，利用小鼠表皮成纖維細胞（L929）對LBL涂層支架，進行細胞相容性及涂層活性功能評價。結果顯示，具有pDA、LBL涂層的之間能更好地促進L929細胞的粘附、增殖及鋪展，而LBL涂層能夠更好地促進細胞在支架表面遷徙、鋪展。說明了該涂層具有很好的生物相容性，以及促進皮膚細胞生長的功能（圖3）。

圖4 LBL涂層HDPE支架抗菌實驗。(a)體外抗菌實驗示意圖及原理。pDA (b-d)和pDA-EFE (e-g)支架上金黃色葡萄球菌活性的SYTO-9/PI分析(j)。附著在pDA (h)和pDA-EFE (i)支架上金黃色葡萄球菌的SEM圖像(k)

隨后，對LBL涂層HDPE支架進行了一系列的抗菌檢測實驗。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為內(nèi)植入物術后最常見的感染菌種，因此我們將pDA和pDA-EFE支架浸泡在兩種菌液中，一段時間后分別進行細菌活死染色及表面掃描電鏡觀察。由于EPL的抗菌性能和FIB干擾細菌粘附的特點，抗菌實驗結果顯示pDA-EFE涂層支架表面的細菌量、存活率明顯要低于pDA支架表面，且粘附在表面的金黃色葡萄球菌表面發(fā)生破裂（EPL的作用主要為破壞細菌壁）（圖4）。

圖5 3D打印耳廓HDPE支架LBL涂層后體內(nèi)實驗。(a) HDPE(耳廓)支架制備工藝及植入方法示意圖。(b)激光掃描確認HDPE(耳廓)支架打印精度。(c)基于有限元分析的原始模型位移梯度分布預測。(d) 28天后標本H&E染色圖像，炎癥細胞統(tǒng)計數(shù)據(jù)(f)。CD68(紅色)和DAPI(藍色)染色熒光圖像(e)和定量分析(g)

最后，我們通過3D打印的方式制備了HDPE耳廓支架，通過三維掃描與設計圖比對結果可以看出，通過3D打印技術可以很好地制備出高精度的HDPE耳廓支架。同時也進行了LBL活性功能涂層，并在SD大鼠的皮下進行了體內(nèi)相容性、皮膚組織長入等檢測。我們先將耳廓之間通過有限元分析的方式分為高偏移和低偏移兩個區(qū)域，假設高偏移區(qū)域可能會由于應力集中而造成更強的炎癥反應。實驗結果表明，LBL活性功能涂層不僅可以緩解HDPE的異物反應炎癥情況，而且可以很好地緩解應力集中所造成的炎癥反應，從而使得皮膚組織也能夠更好地長入支架內(nèi)部。（圖5）

總而言之，該研究開發(fā)了一種具有生物活性和抗菌LBL（Layer-by-layer）涂層，用以修飾具有個性化外觀的3D打印HDPE耳廓支架，以改善術中雕刻困難問題，降低術后并發(fā)癥的發(fā)生率。通過一系列的定性、定量的體內(nèi)外實驗中驗證了該支架，具有個性化的結構特征與良好的表面生物功能活性，顯示出優(yōu)異的抗菌能力、生物相容性，并可減輕炎癥反應、局部應力刺激，促進耳廓支架在體內(nèi)與皮膚組織整合。本研究進一步說明了3D打印技術和LBL涂層方法相結合，具有制備工藝簡單、生物安全性高等特點，在臨床的各類植入物的相關應用方面具有廣闊的潛力。

文章來源：
https://doi.org/10.1016/j.mtbio.2022.100361