Biofabrication|一種可用于3D打印的原位快速溫和聚合成形的新型生物墨水

生物打印是一種可以快速精確地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞空間定位的新興技術(shù)。這一技術(shù)為生物化學(xué)研究帶來了無數(shù)的機(jī)會，例如用于治療修復(fù)的工程組織和用于藥物篩選的體外模型。但是少有生物墨水能夠完全滿足擠出式3D打印的需求，包括良好的可打印性，較高的結(jié)構(gòu)保真度和良好的生物相容性。近日，一篇名為“An injectable bioink with rapid prototyping in theair and in-situ mild polymerization for 3D bioprinting”的文章由中國人民大學(xué)的王亞培教授研究團(tuán)隊在生物制造和生物材料頂級期刊Biofabrication (IF=10.02)上發(fā)表。該研究展示了一種基于明膠、細(xì)菌纖維素(BC)和微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(mTG酶)的復(fù)合生物墨水，它具有出色的可打印性和持久的結(jié)構(gòu)完整性。利用3D打印構(gòu)建的水凝膠細(xì)胞載體可以在體外為細(xì)胞提供有利的生化環(huán)境，支持細(xì)胞生長和增殖。同時體內(nèi)研究也表明，該復(fù)合生物墨水具有優(yōu)良的生物相容性和生物降解性。這種新型復(fù)合生物墨水或許將推動生物3D打印技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。

背景介紹

生物3D打印技術(shù)滿足了對活細(xì)胞的精確空間定位要求，使得重建三維組織和器官復(fù)雜生理微環(huán)境成為可能。在各種生物打印策略中，擠出式生物3D打印由于其相對較低的成本和多功能性已成為最為廣泛研究的技術(shù)之一。盡管已有很多研究來提高擠出式生物3D打印技術(shù)的可重復(fù)性和可靠性，但是現(xiàn)有生物墨水仍然存在幾個關(guān)鍵的挑戰(zhàn): (1)與擠出過程相適應(yīng)的流變性，即可打印性; (2)快速的固化過程以獲得高結(jié)構(gòu)保真度; (3)溫和的固化過程以保護(hù)細(xì)胞; (4)足夠的機(jī)械強(qiáng)度以獲得生理結(jié)構(gòu)所需的穩(wěn)定性。眾多天然大分子中，明膠因其優(yōu)異的生物相容性、生物降解性和非免疫原性而成為生物墨水的經(jīng)典組分。然而，由于明膠固有的低粘度和在生理條件下的不穩(wěn)定性，使其無法直接打印并長期具有高保真度。如何將明膠轉(zhuǎn)化為生物墨水，使其具有適當(dāng)?shù)牧髯冃裕瑴睾偷墓袒�過程，體溫條件下穩(wěn)定而不損害其生物相容性是生物3D打印領(lǐng)域的一個難題。

剪切變稀通常被認(rèn)為是生物墨水的理想特性，可以通過改變聚合物濃度或引入與聚合物鏈有親和力的納米粒子(如粘土納米片/硅酸鹽納米片)來調(diào)節(jié)。細(xì)菌纖維素(BC)是醋酸桿菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的胞外多糖。由于其固有的生物相容性好，拉伸強(qiáng)度高，兼具良好的纖維網(wǎng)絡(luò)和高結(jié)晶度，細(xì)菌纖維素(BC)被用作改變明膠溶液的流變性的輔助材料，使明膠生物墨水在無需冷卻系統(tǒng)輔助的情況下，可以在32℃以上的溫度下擠出，并具有較高的結(jié)構(gòu)保真度。另外，細(xì)菌纖維素(BC)與細(xì)胞外間質(zhì)相似，可以有效地提高細(xì)胞親和力。但是，在37 ℃的生理環(huán)境中，明膠物理交聯(lián)性差，不能提供機(jī)械穩(wěn)定性，因此仍需采用溫和的化學(xué)固化策略。微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(mTG酶)作為交聯(lián)劑用于交聯(lián)豆腐或交聯(lián)牛肉丸中的大豆蛋白，以增加韌性。它在聚合物鏈之間提供分子內(nèi)和分子間的共價結(jié)合點(diǎn)，過程溫和，催化特定位置的鍵合并保證功能基團(tuán)不改變。

結(jié)合細(xì)菌纖維素(BC)和微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(mTG酶)的優(yōu)點(diǎn)，該研究提出了一種新的復(fù)合生物墨水用于生物3D打印，直接擠出載細(xì)胞明膠基結(jié)構(gòu)，具有高的結(jié)構(gòu)保真度和生理環(huán)境中的機(jī)械穩(wěn)定性，有望用于體外組織模型和體內(nèi)組織再生輔助劑。

圖1.(a)剪切變稀水凝膠的打印和原位酶交聯(lián)過程。(b)微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(mTG)催化凝膠過程的機(jī)理。

實(shí)驗(yàn)過程與結(jié)果

1.復(fù)合生物墨水的流變特性

可打印性是生物3D打印技術(shù)的關(guān)鍵影響因素之一，為了滿足適當(dāng)?shù)牧髯冃阅芤�求，將�?xì)菌纖維素(BC)選作流變學(xué)改進(jìn)劑，將明膠溶液轉(zhuǎn)化為可注射的復(fù)合生物墨水。如圖2(a)所示，明膠、細(xì)菌纖維素(BC)和復(fù)合生物墨水分別擠出在垂直的載玻片上。復(fù)合生物墨水可以在載玻片上保持固著液滴的形狀，而另外兩組液滴則迅速向下流動，無法維持其原有形狀。剪切變稀的特征允許混合生物墨水直接打印在玻璃基板上(圖2(b))。如圖2(c)和(d)所示，復(fù)合生物墨水噴嘴擠出后可以保持柱狀，而純的明膠溶液由于表面張力會很快地收縮。從流變測試看，明膠的粘度隨著剪切速率的增加而保持恒定，而細(xì)菌纖維素(BC)的加入使復(fù)合生物墨水具有明顯的剪切變稀行為(圖2(e))。此外，類固體生物墨水表現(xiàn)出屈服應(yīng)力行為，這有利于三維打印過程。

圖2.(a)明膠(20 wt%)，細(xì)菌纖維素(0.65 wt%)和復(fù)合生物墨水(20 wt%明膠+0.65 wt%細(xì)菌纖維素)擠出在垂直玻璃載片上的照片。(b) 復(fù)合生物墨水?dāng)D出示意圖(左)及照片(右)。比例尺: 1 cm。(c)、(d)明膠與復(fù)合生物墨水的可打印性比較。(e)混入不同濃度細(xì)菌纖維素所得生物墨水(20 wt% 明膠)粘度與剪切速率的關(guān)系。(f)不同應(yīng)力作用下，復(fù)合生物墨水的儲能模量和損耗模量曲線。(g)混入不同濃度細(xì)菌纖維素所得生物墨水(20 wt% 明膠)的屈服應(yīng)力。

2.復(fù)合生物墨水在生理條件下的穩(wěn)定性

該研究中，微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(mTG酶)可以催化蛋白質(zhì)鏈之間共價鍵的形成化學(xué)交聯(lián)。如圖3(a)所示，現(xiàn)有兩種類型的錦鯉魚形水凝膠，不加酶的明膠水凝膠在室溫下穩(wěn)定，在生理溫度下融化。但是另外一組中，酶的催化交聯(lián)作用可以讓水凝膠在生理溫度下仍能保持成形結(jié)構(gòu)。此外如圖3(b)所示，增加酶的濃度可以縮短固化時間。流變學(xué)數(shù)據(jù)在圖3(c)定量表征了酶催化交聯(lián)過程，即隨著時間的推移，儲能模量逐漸增。凝膠復(fù)合材料的力學(xué)性能可以通過調(diào)節(jié)明膠和細(xì)菌纖維素(BC)的用量來調(diào)節(jié)，如圖3(e)所示。

圖3. (a)內(nèi)部不含微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶和內(nèi)部含酶的錦鯉魚形水凝膠結(jié)構(gòu)在室溫與生理溫度下的形狀。(b)不同濃度的酶固化復(fù)合生物墨水所用時長。(c) 20 min固化過程中復(fù)合生物墨水儲能模量的變化趨勢。(d)復(fù)合生物墨水與0.2g/ml谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶形成的水凝膠在凍干后的掃描電鏡圖。(e)含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)細(xì)菌纖維素的水凝膠儲存模量變化(0.2g/ml谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶)。(f)含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)細(xì)菌纖維素的水凝膠的應(yīng)力-應(yīng)變曲線。(g)含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)細(xì)菌纖維素的水凝膠(20 wt% 明膠)楊氏模量。

3.可用于復(fù)雜水凝膠結(jié)構(gòu)的打印

基于流變學(xué)研究，復(fù)合生物墨水可被用于3D打印。所有的3D打印實(shí)驗(yàn)均由上普的BioMaker打印機(jī)完成。設(shè)計的3D模型和打印的3D結(jié)構(gòu)(耳朵和半月板結(jié)構(gòu))之間的比較證明了生物墨水的高打印保真度(圖4(a)和(b))。碗狀結(jié)構(gòu)打印進(jìn)一步證明了復(fù)合生物墨水的自支撐性能，如圖4(f)和(g)所示。

圖4. 利用復(fù)合生物墨水打印可得各種三維結(jié)構(gòu)。(a)耳朵形狀和(b)半月板形狀的俯視圖。(c)耳朵形狀和(d)半月板形狀的側(cè)視圖。(e)網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的俯視圖和放大視圖。(f)、(g)碗狀水凝膠結(jié)構(gòu)。(h)網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的側(cè)視圖。比例尺: 1cm。

4.體外細(xì)胞相容性評價

通過細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和細(xì)胞活性評價了復(fù)合明膠生物墨水的細(xì)胞相容性。選用 大鼠動脈內(nèi)皮細(xì)胞(RAOEC)細(xì)胞、正常肝細(xì)胞(LO2)進(jìn)行細(xì)胞相容性評價。如圖5(a)所示， 細(xì)胞在水凝膠表面生長良好且有伸展現(xiàn)象。此外，包裹在水凝膠中的細(xì)胞在凝膠化后仍然保持高活性(圖5(b))。隨后用CCK-8法對水凝膠樣品進(jìn)行了細(xì)胞毒性測定，如圖5(g)和(h)所示，含有不同量明膠或微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(mTG酶)的水凝膠的細(xì)胞活力超過100%。據(jù)推測，該復(fù)合墨水完全由生物大分子組成，生物大分子不僅具有良好的生物相容性，而且具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的潛力。

圖5. (a)在水凝膠表面培養(yǎng)大鼠動脈內(nèi)皮細(xì)胞。(b)在水凝膠內(nèi)包裹人肝正常細(xì)胞。 3D打印水凝膠結(jié)構(gòu)體在體外培養(yǎng)(c)1、(d) 3、(f)7天后的活死染色圖像 (e)為(d)的放大圖像。 (比例尺: 100微米)； (g)含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)明膠的水凝膠(0.65 wt%細(xì)菌纖維素+0.2g/ml谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶)的細(xì)胞活性測試結(jié)果(n = 4)。(h)含不同濃度谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的水凝膠(20 wt%明膠+0.65 wt%細(xì)菌纖維素)的細(xì)胞活性測試結(jié)果(n = 4)。

5.體內(nèi)生物相容性

除了細(xì)胞相容性，體內(nèi)生物相容性和降解性對于水凝膠的植入同樣很重要。因此，通過體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)評價了復(fù)合生物墨水和酶固化水凝膠的相容性和降解性。圖6(a)是皮下植入過程的示意圖。所有動物在實(shí)驗(yàn)期間均保持存活，沒有明顯的惡性腫瘤，感染或膿腫(圖6(c)-(f))。HE染色的組織切片顯示皮膚結(jié)構(gòu)完整，注射后未發(fā)現(xiàn)表皮或真皮改變。固化后的水凝膠在植入后三個月后降解，如圖6(k)所示。此外，病理切片結(jié)果表明，水凝膠的降解產(chǎn)物也是無毒的，不會激活免疫應(yīng)答。

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圖6. (a)皮下植入過程示意。(b)植入小鼠體內(nèi)的位置。(c)-(f)手術(shù)后7天、14天、28天和60天植入部位的照片，虛線表示水凝膠所在區(qū)域。比例尺: 1 cm。(g)-(j)利用蘇木精-伊紅染色表征水凝膠植入后7天、14天、28天和60天的組織切面情況。星號代表植入的水凝膠區(qū)域。比例尺: 100μm。(k)90天后植入的水凝膠在體內(nèi)的圖像。比例尺: 1 cm。利用蘇木精-伊紅染色表征(1)水凝膠、(m)對照組(無植入物)和(n)皮下注射PBS組植入90天后組織切面情況。比例尺: 100 μm。

結(jié)論

該研究研發(fā)了一種新的基于明膠的復(fù)合生物墨水，能夠直接用于生物3D打印含細(xì)胞的水凝膠結(jié)構(gòu)，具有高結(jié)構(gòu)保真度、可調(diào)節(jié)的機(jī)械性能和良好的生物相容性。體外研究表明，該水凝膠的三維結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞粘附，細(xì)胞遷移和細(xì)胞增殖。植入實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該水凝膠具有良好的生物相容性和生物降解性。未來的工作可能會進(jìn)一步研究生物墨水與不同細(xì)胞(如軟骨細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞等)的相互作用，探索其在組織工程中的潛在功能。

參考文獻(xiàn)

Zhou Y, Liao S, Chu Y, et al. An injectable bioinkwith rapid prototyping in the air and in-situ mild polymerization for 3Dbioprinting[J]. Biofabrication, 2021, 13(4): 045026.

https://doi.org/10.1088/1758-5090/ac23e4