使用基于微孔光交聯(lián)脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)的生物墨水進(jìn)行耳廓軟骨的生物打印和再生

來源：生物打印與再生工程


組織工程為耳廓重建提供了一種有前景的策略。盡管基于聚合物支架實(shí)現(xiàn)了組織工程耳廓重建的第一個(gè)國際臨床突破，但由于其臨床療效不理想，該方法尚未被認(rèn)為是臨床可用的治療方法。這主要是因?yàn)橹亟ńY(jié)構(gòu)容易引起炎癥和變形。

近期中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院蔣海越教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合院外單位團(tuán)隊(duì)在Bioactive Materials在線發(fā)表了題為“Bioprinting and regeneration of auricular cartilage using a bioactive bioink based on microporous photocrosslinkable acellular cartilage matrix”的研究論文。在這項(xiàng)研究中，該團(tuán)隊(duì)提出了一種通過集成多噴嘴生物打印，在甲基丙烯酸明膠 (GelMA)、聚環(huán)氧乙烷 (PEO) 和聚己內(nèi)酯 (PCL) 的幫助下，使用耳廓軟骨細(xì)胞和基于仿生微孔甲基丙烯酸酯修飾的無細(xì)胞軟骨基質(zhì) (ACMMA) 的生物活性生物墨水技術(shù)，開發(fā)具有精確形狀、低免疫原性和優(yōu)良力學(xué)的生物耳廓等效物的新方法。可光交聯(lián)的 ACMMA 用于模擬軟骨特異性微環(huán)境的復(fù)雜性，以實(shí)現(xiàn)活躍的細(xì)胞行為，GelMA、PEO 和 PCL 用于平衡可打印性和物理特性以實(shí)現(xiàn)精確的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，并且形成微孔結(jié)構(gòu)以實(shí)現(xiàn)暢通無阻的營養(yǎng)交換，為更高的形狀保真度提供機(jī)械支撐。最后，在體內(nèi)成功再生出形態(tài)保真度高、彈性好、軟骨腔豐富、軟骨特異性ECM沉積豐富的成熟耳廓軟骨樣組織，為患者特異性耳廓軟骨的制備和再生提供了新的機(jī)會(huì)和新的方法。

圖1 全文圖形概要。

實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果
1. 脫細(xì)胞軟骨基質(zhì) (ACM) 的制備
在無菌條件下從巴馬小型豬中分離出耳軟骨。去除皮膚后，將剩余的耳軟骨組織切成小塊。使用預(yù)冷的無菌去離子水沖洗獲得的軟骨片，并使用自動(dòng)樣品冷凍研磨機(jī)研磨成粉末。軟骨粉依次用 0.5%胰蛋白酶/磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)、核酸酶溶液（在 10 mM Tris-HCl，pH = 7.5 中含有 50 U/ml 脫氧核糖核酸酶和 1 U/ml 核糖核酸酶 A）、10 mM Tris- HCl（包括 10 U/ml 抑肽酶）和 1% Triton X-100/PBS 溶液用于脫細(xì)胞。在冷凍干燥過程之后，10將mg/ml的脫細(xì)胞軟骨粉末在2mg/ml的膠原酶溶液中在室溫下酶解24小時(shí)，同時(shí)持續(xù)攪拌以形成可流動(dòng)的粘性溶液。將粘性溶液終止并用 3,500 D 透析膜在去離子水中透析 72 小時(shí)。最后將制備好的ACM凍干，-20℃保存?zhèn)溆谩?br />

圖2. 脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)的制備和蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

A) 通過脫細(xì)胞和酶解程序制備ACM。B) DNA 含量、GAG含量和膠原蛋白含量的定量分析。

2. 脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)的甲基丙烯酸化和具有微孔結(jié)構(gòu)的ACMMA基水凝膠的制備
為了制備可光交聯(lián)的水凝膠，ACM 被甲基丙烯酸酐 (MA) 改性。簡而言之，將 0.5 g 水溶性ACM  溶解在去離子水中，并在冰浴中以 0.5 mL/min 的速率加入 0.5 mL MA。用 5 M NaOH 將 pH 值保持在 8 和 10 之間，并在不斷攪拌下繼續(xù)反應(yīng)過夜。反應(yīng)后，用1M HCl中和溶液，用3,500D透析膜在蒸餾水中透析1周，然后冷凍和凍干。

在細(xì)胞載入前12小時(shí)制備預(yù)凝膠溶液。凍干的 ACMMA和GelMA都完全溶解在培養(yǎng)基中，分別達(dá)到5%的最終ACMMA和GelMA 濃度。光引發(fā)劑LAP粉末完全溶解在溶液中，最終 LAP濃度為0.25%。將成孔劑PEO（平均 Mw = 300,000）粉末溶解在溶液中，使PEO的最終濃度達(dá)到1%�；�于相分離空隙形成策略，采用ACMMA/GelMA和PEO聚合物的兩種生物相容性溶液的水性兩相乳液在隨后的光交聯(lián)和浸出過程中制備微孔水凝膠。所有水凝膠制劑在連續(xù)攪拌下充分混合，用注射器過濾器（0.45 μm孔徑）消毒，并保存在培養(yǎng)箱中避光。最后，通過暴露于藍(lán)光（波長：405 nm；強(qiáng)度：20 mW/cm2；距離：10 cm；曝光時(shí)間：60 s）誘導(dǎo)水凝膠交聯(lián)。

圖3. 甲基丙烯酸化脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)水凝膠的甲基丙烯酸化機(jī)理和光交聯(lián)過程。

A)GELMA 和 ACMMA 的甲基丙烯酸化機(jī)理，以及在藍(lán)光照射 (405 nm, 20 mW/cm 2 ) 下從可流動(dòng)的預(yù)凝膠溶液到固化水凝膠的光交聯(lián)機(jī)理。B) GelMA、ACMMA 的1 H NMR 光譜和 ACMMA/GelMA 凝膠前體的光交聯(lián)過程（紅色箭頭表示甲基丙烯酰胺基團(tuán)的信號(hào)峰在 5.4 和 5.6 ppm）。C) 基于 ACMMA 生物墨水的格子狀結(jié)構(gòu)的光交聯(lián)過程和生物打印過程。

3.微孔水凝膠的理化性質(zhì)
   

圖4. 微孔水凝膠的物理化學(xué)性質(zhì)。

A)打印通過溶解PEO的微孔水凝膠的示意圖說明對(duì)細(xì)胞行為有益。B)示意圖和光學(xué)圖像，羅丹明 B（與羅丹明 B 結(jié)合的水凝膠網(wǎng)絡(luò)發(fā)出紅色熒光，而深色區(qū)域表示微孔），以及與無孔水凝膠相比顯示微孔結(jié)構(gòu)的 H&E。生物墨水的流變特性：C) 儲(chǔ)能模量 (Gʹ) 和損耗模量 (Gʹʹ)，D) 凝膠時(shí)間，E) 剪切模量，F(xiàn)) 粘度性能，以及 G) 溫度敏感特性。 H) 酶介導(dǎo)的生物墨水降解。

4. 微孔生物墨水的生物相容性分析

圖5. 微孔生物墨水的生物相容性分析。

A) Calcein-AM 染色測試的細(xì)胞遷移示意圖（綠色箭頭表示細(xì)胞遷移）。B) 活死染色 (綠色熒光和紅色熒光分別代表活細(xì)胞和死細(xì)胞) 和 C) 細(xì)胞活力和細(xì)胞負(fù)載構(gòu)建體中軟骨細(xì)胞 DNA 含量的量化。D) Ki67 的免疫熒光（綠色熒光表示增殖細(xì)胞，黃色箭頭表示正在分裂的細(xì)胞）和 E) 細(xì)胞周期分析以評(píng)估細(xì)胞增殖。

5. 生物打印網(wǎng)格狀細(xì)胞負(fù)載結(jié)構(gòu)進(jìn)行體內(nèi)軟骨再生

圖6. 使用生物打印格子狀細(xì)胞負(fù)載結(jié)構(gòu)進(jìn)行體內(nèi)軟骨再生。

A) 4 周、B) 8 周和 C) 12 周的體內(nèi)培養(yǎng)后工程軟骨樣組織的 H&E、番紅-O、阿爾新藍(lán)和膠原 II 染色的大體視圖和組織學(xué)染色。D)體內(nèi)培養(yǎng) 4 周、8 周和 12 周后再生軟骨樣組織的GAG含量、膠原蛋白含量、DNA 含量、GAG/DNA、膠原蛋白/DNA 和楊氏模量的生化和生物力學(xué)定量評(píng)估（n = 5)。紅色箭頭：細(xì)胞或分泌的 ECM。綠色箭頭：殘留的水凝膠材料。黑色箭頭：微孔結(jié)構(gòu)。

6. 使用基于 ACMMA 的微孔生物墨水進(jìn)行耳廓軟骨的生物打印和再生

圖7. 使用基于 ACMMA 的微孔生物墨水進(jìn)行耳廓軟骨的生物打印和再生。

A) 基于 ACMMA 微孔生物墨水的人體耳廓和生物打印耳廓構(gòu)造的 3D 數(shù)字模型。B) 生物打印耳廓結(jié)構(gòu)的活/死染色。C) 在裸鼠中培養(yǎng) 12 和 24 周后再生耳廓軟骨。D)再生耳廓軟骨的3D重建和3D偏差比較。E)在體內(nèi)培養(yǎng) 24 周后，再生耳廓軟骨的 H&E、番紅-O、阿爾新藍(lán)和膠原蛋白 II 染色。

7. 使用基于 ACMMA 的微孔生物墨水和 PCL 支持進(jìn)行耳廓軟骨的生物打印和再生

圖8. 使用基于 ACMMA 的微孔生物墨水和 PCL 支持進(jìn)行耳廓軟骨的生物打印和再生。

A) 基于 ACMMA 微孔生物墨水和 PCL 的人體耳廓和生物打印耳廓等效物的 3D 數(shù)字模型。B) 生物打印耳廓結(jié)構(gòu)的活/死染色。C) 在裸鼠中培養(yǎng) 12 和 24 周后再生耳廓軟骨。D)再生耳廓軟骨的3D重建和3D偏差比較。E)在體內(nèi)培養(yǎng) 24 周后，再生耳廓軟骨的 H&E、番紅-O、阿爾新藍(lán)和膠原蛋白 II 染色。

8. 再生耳廓軟骨的定量分析

圖9. 再生耳廓軟骨的定量分析。

再生耳廓軟骨的形狀保真度在 A) ± 1 mm 和 B) ± 2 mm 的偏差范圍內(nèi)。C) 工程軟骨面積的量化。D) GAG含量、E) 膠原含量、F) DNA 含量、G) 應(yīng)力-應(yīng)變曲線和 H)再生耳廓軟骨的楊氏模量的生化和生物力學(xué)評(píng)估。

PCL的引入顯著提高了耳廓結(jié)構(gòu)的形狀保真度（圖9 A和B），但唯一的不足是緩慢降解的PCL的空間占用影響了工程軟骨的形成和整合（圖9 C）。與組織學(xué)結(jié)果一致，定量分析（圖 9 D-F）顯示，無論是否有 PCL 支持，再生耳廓軟骨的膠原蛋白含量均達(dá)到原生軟骨的 85% 以上（* p  < 0.05），而 GAG 含量和DNA含量幾乎達(dá)到天然軟骨水平，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異（ p  ＞ 0.05）。同時(shí)，生物力學(xué)性能表明，沒有PCL支持的再生耳廓軟骨的模量達(dá)到原生軟骨的65%以上，而有PCL支持的再生耳廓軟骨的模量達(dá)到了原生軟骨的2.6倍左右（* p  < 0.05） （圖 9 G 和 H）。這些結(jié)果表明，PCL的存在雖然存在空間占用問題，但在提供足夠強(qiáng)度和剛度支撐的同時(shí)，并不影響生物墨水區(qū)域成熟軟骨組織的形成。

總結(jié)
綜上，該團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種基于軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的光敏多孔仿生生物墨水，使用多噴頭3D打印技術(shù)，能夠制造具有精確形狀、低免疫原性和優(yōu)良力學(xué)性能的耳廓仿生結(jié)構(gòu)，為個(gè)性化耳廓形態(tài)軟骨的制備和再生提供了新的材料和新的方法。


參考文獻(xiàn)
Bioprinting and regeneration of auricular cartilage using a bioactive bioink based on microporous photocrosslinkable acellular cartilage matrix, Bioactive Materials 16 (2022) 66–81.
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2022.02.03