生物3D打印心臟補(bǔ)片通過(guò)激活A(yù)NGPT1/Tie2通路

供稿人：韓康 賀健康 供稿單位：西安交通大學(xué)機(jī)械制造系統(tǒng)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室


基于生物3D打印技術(shù)的新型組織工程策略已成為一種治療動(dòng)物模型中急性心肌梗死的有效方法。然而，由于移植物存活率低，生物3D打印組織的應(yīng)用仍然受到限制。因此，通過(guò)精確調(diào)節(jié)包裹細(xì)胞的3D環(huán)境來(lái)提高移植物的存活率是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。目前，韓國(guó)高麗大學(xué)Do-Sun Lim教授團(tuán)隊(duì)使用人心肌細(xì)胞、人心肌成纖維細(xì)胞和明膠-甲基丙烯酰-膠原水凝膠等材料以及生物3D打印技術(shù)，制備了一種具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的新型可移植3D心肌補(bǔ)片（cMesh）。心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞在補(bǔ)片中分布良好，且心肌細(xì)胞通過(guò)間隙連接通道相互連接促進(jìn)心肌細(xì)胞成熟與交流。此外，多孔cMesh補(bǔ)片通過(guò)增加與細(xì)胞存活相關(guān)的mTOR、AKT和ERK信號(hào)的磷酸化來(lái)顯示其結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)。在急性心肌梗死大鼠中移植cMesh補(bǔ)片可改善移植物長(zhǎng)期存活率、血管形成和穩(wěn)定性、減少纖維化、增加左心室厚度和增強(qiáng)心臟功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了多孔cMesh在急性心肌梗死動(dòng)物模型中提供了結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)和積極的治療效果。

使用生物3D打印技術(shù)制備的cMesh補(bǔ)片相較于手動(dòng)聚合的cPatch補(bǔ)片具有其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)（圖1A）。 對(duì)cPatch和cMesh補(bǔ)片的內(nèi)外部區(qū)域細(xì)胞死亡的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)顯示（圖1B），cPatch組內(nèi)部死亡細(xì)胞率為15%±2.44%，外部死亡細(xì)胞率為10%±0.99%。 相比之下，cMesh中的死亡細(xì)胞比例在內(nèi)部區(qū)域保持在3.5%±0.82%，在外部區(qū)域?yàn)?.1%±1.61%。 基于活/死細(xì)胞活力測(cè)定的結(jié)果，進(jìn)一步進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析以確認(rèn)cMesh組和cPatch組中與細(xì)胞存活相關(guān)的mTOR、ERK和AKT蛋白的表達(dá)水平（圖1C）。 結(jié)果顯示，與cPatch組相比，cMesh組中的磷酸化mTOR、AKT和ERK信號(hào)表達(dá)顯著增加，表明多孔cMesh補(bǔ)片能夠顯著促進(jìn)移植物中細(xì)胞的存活。 利用透射電鏡更詳細(xì)地觀察了細(xì)胞間的相互作用（圖1D）。 在第0天，細(xì)胞無(wú)法相互交流。 第2天，觀察到細(xì)胞鋪展過(guò)程，細(xì)胞與其他細(xì)胞接觸，但沒(méi)有連接。 在第4日，觀察到通過(guò)細(xì)胞間膜連接的細(xì)胞。 此外，與細(xì)胞膜相互作用的Cx-43和ZO-1蛋白的共表達(dá)證實(shí)了cMesh中存在結(jié)構(gòu)成熟的人心肌細(xì)胞（圖1E）。

圖1 多孔cMesh補(bǔ)片具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)。(A) cPatch和cMesh制造示意圖，包括多細(xì)胞生物墨水。(B) cPatch和cMesh的內(nèi)部和外部區(qū)域示意圖。對(duì)外部和內(nèi)部區(qū)域的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，以確定活細(xì)胞（綠色）和死細(xì)胞（紅色）的分布。(C) 代表性的蛋白質(zhì)印跡分析定量數(shù)據(jù)顯示cMesh與cPatch中mTOR、AKT和ERK的磷酸化情況。(D) 透射電鏡顯示cMesh內(nèi)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。(E) 細(xì)胞間相互作用的標(biāo)志物ZO-1（綠色）和 Cx-43（紅色）代表性染色圖像。

為了研究多孔cMesh補(bǔ)片修復(fù)急性心肌梗死的細(xì)胞因子效應(yīng)，與心臟重塑（MCP-1、ErbB2、MMP-9、MMP-2、TIMP-2、TIMP-1）和血管生成（PDGF-BB、SDF-1、ANGPT-1、ANG、bFGF、EGF）相關(guān)的細(xì)胞因子陣列在補(bǔ)片植入28天后進(jìn)行檢測(cè)。與第28天的假手術(shù)組和cPatch組相比，cMesh組中高度檢測(cè)到ANGPT1（圖2A）。同時(shí)，量化數(shù)據(jù)顯示，與假手術(shù)組和cPatch組相比，cMesh 組的ANGPT1顯著增強(qiáng)（圖2B）。然而，與假手術(shù)組相比，cPatch組的ANGPT1水平?jīng)]有顯著差異，因此，在第7天和第28天，使用血清進(jìn)行ELISA測(cè)定來(lái)估計(jì)cMesh和cPatch組中的ANGPT1的表達(dá)。cMesh組中的ANGPT1水平在第7天與cPatch組中的定量相似。相反，與cMesh組相比，cPatch中的ANGPT1水平在第28天顯著降低（圖2C-D）。為了定量比較cMesh和cPatch組中ANGPT-1受體Tie-2表達(dá)，通過(guò)qPCR和蛋白質(zhì)印跡分析確認(rèn)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)水平（圖2E-G）。cMesh組Tie-2基因表達(dá)量高于cPatch組。在第28天，與cPatch組相比，cMesh組的蛋白表達(dá)水平也顯著增強(qiáng)。基于先前與血管生成相關(guān)的ANGPT/Tie2結(jié)果，進(jìn)行了免疫熒光檢測(cè)以評(píng)估梗死周?chē)鷧^(qū)域的血管生成（圖2H）。在移植cMesh和cPatch后的第28天，與假手術(shù)組相比，cMesh組和cPatch組的血管生成更顯著。此外，與cPatch相比，cMesh組SMA陽(yáng)性血管總數(shù)增加（圖2I）。此外，將SMA陽(yáng)性血管總數(shù)細(xì)分為小、中、大血管，cMesh組中大血管的比例高于cPatch和假手術(shù)組（圖2J）。

圖2 移植cMesh補(bǔ)片急性心肌梗死大鼠的心臟結(jié)構(gòu)維持和血管形成通過(guò)激活A(yù)NGPT1/Tie2通路得到改善。(A-B) 假手術(shù)組、cPatch組和cMesh組裂解物的代表性心臟重塑和血管生成細(xì)胞因子陣列面板與定量分析。(C-D) ELISA測(cè)定cPatch和cMesh組中ANGPT1在第7天和第28天的含量。(E) 定量PCR檢測(cè)cMesh組與cPatch組大鼠Tie2 mRNA表達(dá)水平。(F-G) cMesh組與cPatch組大鼠Tie2蛋白質(zhì)印跡圖像和量化數(shù)據(jù)。(H) 假手術(shù)、cPatch cMesh組中成熟血管的免疫熒光圖像。(I-J) SMA陽(yáng)性血管的定量分析和SMA陽(yáng)性血管的比例。

這項(xiàng)工作結(jié)果表明，生物3D打印制備的多孔心肌補(bǔ)片具有適合的微環(huán)境和機(jī)械特性，能夠提高細(xì)胞活力并在體內(nèi)長(zhǎng)期保留大量細(xì)胞，并且有可能提高組織再生的效率。
參考文獻(xiàn)：

    金 KS、Joo HJ、Choi SC 等。 3D生物打印心臟網(wǎng)片移植通過(guò)ANGPT1/Tie2通路改善急性心肌梗死大鼠心臟功能和血管形成[J]. 生物制造, 2021, 13(4): 045014. https://doi.org/10.1088/1758-5090/acle78。