脫細胞椎間盤水凝膠對人骨髓間充質(zhì)干細胞的組織特異性分化和再生研究

來源：生物打印與再生工程

細胞行為與其所處的微環(huán)境密切相關(guān)。不同組織呈現(xiàn)給駐留細胞的微環(huán)境也不盡相同，因而存在組織特異性。深入研究組織特異性與細胞行為的內(nèi)在聯(lián)系對于體外調(diào)控細胞行為和體內(nèi)組織修復(fù)具有重要的指導(dǎo)意義。近日，來自華中科技大學(xué)的Shao Zengwu & Lei Ming和中山大學(xué)的Quan Daping團隊通過將椎間盤內(nèi)兩塊相鄰的不同組織脫細胞并制成水凝膠，系統(tǒng)研究了人骨髓間充質(zhì)干細胞在其中的組織特異性分化。研究發(fā)現(xiàn)，這種組織特異性分化不僅依賴于脫細胞組織基質(zhì)的材料組成，還與其培養(yǎng)方式(2D還是3D)相關(guān)。通過對RhoA/LATS/YAP1信號通路的系統(tǒng)分析，研究人員發(fā)現(xiàn)YAP1的調(diào)控在組織特異性分化中具有重要作用。最后，研究人員評估了組織特異性在組織再生中的積極作用。

椎間盤退化(IDD)是影響骨骼肌系統(tǒng)功能的常見疾病之一�，F(xiàn)有的臨床治療手段如手術(shù)治療、局部封堵和保守治療效果欠佳，亟需開發(fā)新的治療策略。最近數(shù)十年，基于生物機械修復(fù)機制的生物材料治療引起了研究人員的極大興趣。用于椎間盤修復(fù)的主要生物材料包括不可降解的聚丙烯酸酯和聚丙烯酰胺以及可降解的透明質(zhì)酸、膠原和殼聚糖。然而，這些植入材料往往不能很好地調(diào)控傷口微環(huán)境、組織退化、水分流失和炎癥反應(yīng)。到目前為止，利用生物材料實現(xiàn)椎間盤再生和恢復(fù)組織完整性還未取得令人滿意的臨床結(jié)果。

治療IDD的另一種思路是細胞療法�；�于干細胞的細胞療法在治療IDD上已經(jīng)取得了一些有益的結(jié)果。例如，體內(nèi)注射間充質(zhì)干細胞并將其分化為椎間盤細胞促進了椎間盤組織細胞外基質(zhì)(ECM)的合成。然而，由于缺乏適宜的細胞載體材料，這種方法面臨的最直接問題是低細胞存活率和干細胞分化不可控。大量研究表明，脫細胞組織基質(zhì)(DTM)去除了免疫原性而保留了原有組織的大部分功能性成分(如細胞因子、基質(zhì)結(jié)合納米囊泡和蛋白)和3D超微結(jié)構(gòu)，是一種理想的細胞載體材料。其中，DTM水凝膠不僅能夠作為細胞的物理載體，還能通過其組織特異性調(diào)控細胞行為。椎間盤的主要功能構(gòu)成包括髓核(NP)核纖維環(huán)(AF)，而這兩種相鄰組織在組成和結(jié)構(gòu)上存在差異。于是，研究人員提出一個問題：這種組織差異性能否特異性地誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向?qū)��?yīng)的組織進行分化？

另一方面，研究人員也注意到了細胞微環(huán)境的空間特征對干細胞行為的影響。例如，3D環(huán)境可提供額外的刺激以促進成骨分化。對于肌成纖維細胞的分化，2D和3D培養(yǎng)存在巨大差異。因為NP細胞和AF細胞在體內(nèi)具有不同的空間特征，因此在研究干細胞的組織特異性分化時兼顧培養(yǎng)方式的影響也十分有必要。

在這篇論文中，研究人員首先制備了脫細胞髓核和纖維環(huán)以及對應(yīng)的水凝膠(DNP-G和DAF-G)，并評估了脫細胞工藝和表征了水凝膠的基本性能。然后，研究人員利用蛋白組學(xué)工具分析了兩種水凝膠的組成異同，并確定了差異組成和特異性標志物。緊接著，研究人員分別研究了人骨髓間充質(zhì)干細胞(hBMSCs)在不同的水凝膠材料中的特異性分化。為弄清楚組織特異性分化的具體機制，研究人員對整合素介導(dǎo)的Rho/LATS/YAP1信號通路進行了重點分析。最后，研究人員還評估了這兩種水凝膠在大鼠椎間盤模型中的組織特異性再生功能。圖1給出了大致的研究思路和內(nèi)容。

圖1 DTM制備過程和體內(nèi)外應(yīng)用示意圖

1.脫細胞及DNP-G和DAF-G的制備和表征
研究人員首先評估了脫細胞工藝。H&E染色和DAPI染色表明大部分細胞成分已被去除，而且殘留DNA含量也降低至國際通用標準(50 ng/mg)以下，表明使用脫細胞工藝的有效性(圖2a-c)。同時，在脫細胞過程中ECM主要成分膠原和糖胺聚糖(GAGs)得到了很好的保留(圖2d-e)。掃描電鏡(SEM)顯示兩種不同的DTM具有不同的微觀結(jié)構(gòu)：DAF的納米纖維結(jié)構(gòu)取向性和直徑略高于DNP(圖2f)。流變表征顯示，DAF-G比DNP-G有更短的凝膠時間和更高的儲能模量(圖2g)。然后，研究人員利用蛋白質(zhì)學(xué)分析確定了兩種DTM蛋白組成和成分差異(圖2h-i)�；�于基因本體(GO)數(shù)據(jù)庫的分子功能(MF)分析表明，DNP-G中的蛋白質(zhì)豐度更高，并與GAGs結(jié)合、蛋白二聚活性、催化活性、結(jié)構(gòu)分子活性和糖類衍生物結(jié)合等相關(guān)(圖2j)。細胞活死染色和CCK8試驗表明DNP-G和DAF-G均具有良好的細胞相容性，而皮下異種移植模型實驗表明兩種DTM引起的炎癥反應(yīng)不明顯。

圖2 DNP-G和DAF-G的成分差異、形貌和流變性能表征和蛋白組學(xué)分析

2. DNP-G和DAF-G對hBMSCs的定向分化

為了區(qū)分NP和AF兩種細胞，研究人員首先確定了對應(yīng)的特異性標志物。在研究DTM水凝膠對hBMSCs的定向分化之前，研究人員先考察了DTM溶液對hBMSCs定向分化的影響(Ⅰ型膠原為對照組)。通過S&O染色和免疫組織化分析，研究人員發(fā)現(xiàn)NP特異性標志物(CD24和COL2A1)的陽性染色在DNP組中更明顯，而AF特異性標志物(COL1A1和TNMD)的陽性染色在DAF組中更明顯(圖3a)。上述結(jié)果說明DNP和DAF溶液具有誘導(dǎo)hBMSCs定向分化為NP何AF細胞的潛力。為進一步驗證這種組織特異性分化，研究人員分析了特異性標志物在不同水凝膠和不同培養(yǎng)條件(2D和3D)下的表達，發(fā)現(xiàn)3D培養(yǎng)21天后NP標志物(COL2A1，CD24，KRT19，ACAN和NCAM1)在DNP-G中表達上調(diào)(圖3b)。另外，免疫熒光染色、蛋白質(zhì)印跡和灰度分析顯示NP標志物GPC3的熒光強度和表達量強于其他組，特別是在3D培養(yǎng)環(huán)境下(圖3c-d)。通過對比2D和3D培養(yǎng)環(huán)境下NP標志物的表達，研究人員發(fā)現(xiàn)DNP-G在3D環(huán)境下更能促進hBMSCs向NP分化(圖3e)。基于蛋白組學(xué)的分析，研究人員推測這可能與DNP中的FGF18有關(guān)。FGFG18能夠通過上調(diào)ACAN和COL2A1表達以促進軟骨分化。另外，DNP除了含有多種生長因子外，還包含豐富的膠原如COL2A1、COL11A2和COL9A3。其中，Ⅱ型膠原能夠促進間充質(zhì)干細胞向NP分化。另一方面，健康的NP組織高度水合，從而在椎間盤發(fā)育過程中將NP細胞包裹在類似凝膠的微環(huán)境中。所以，DNP-G以3D方式培養(yǎng)hBMSCs更有助于其向NP細胞分化。

不同的是，DAF-G誘導(dǎo)hBMSCs向AF分化，特別是在2D環(huán)境下(圖4a)，而且2D培養(yǎng)下AF標志物TNMD的表達高于其他組(圖4b-c)。對比2D和3D培養(yǎng)環(huán)境，hBMSCs在DAF-G 2D環(huán)境下能表達更多的AF標志物(圖4d)。同樣是基于蛋白組學(xué)分析，研究人員認為這與DAF中的TGF-β1有關(guān)，因為TGF-β1是一個維持AF細胞表型的有效因子(雖然它也能誘導(dǎo)NP分化)。另外，DAF-G中存在的Ⅰ型膠原能夠促進間充質(zhì)干細胞的AF分化。另一方面，天然AF組織具有層狀結(jié)構(gòu)特征，迫使AF細胞以伸展的形態(tài)嵌在片層之間，相當于AF細胞接種在基底表面。所以，DAF-G以2D培養(yǎng)hBMSCs有助于其向AF細胞分化。以上結(jié)果說明hBMSCs的組織特異性分化不僅取決于DTM的組成，還受其空間特征(培養(yǎng)方式)的影響。

圖3 DNP-G 3D培養(yǎng)誘導(dǎo)hBMSCs向NP細胞分化

圖4 DAF-G 2D誘導(dǎo)hBMSCs向AF細胞分化

3. DAF-G 2D激活整合素介導(dǎo)的RhoA/LATS/YAP1信號通路

整合素轉(zhuǎn)導(dǎo)的Hippo/YAP1信號通路通過感知細胞粘附并將機械信號從胞外傳遞至胞內(nèi)受體以調(diào)節(jié)細胞活動。然而，上述信號通路在DNP-G和DAF-G的組織和空間特異性中的具體作用還未被確定。研究人員首先利用免疫熒光染色表征了細胞的粘附特性，發(fā)現(xiàn)在DAF-G 2D培養(yǎng)條件下hBMSCs具有更大的細胞覆蓋面積和黏著斑面積，說明DAF-G 2D能顯著增強細胞-ECM粘附(圖5a-b)。接下來，研究人員考察了4個整合素亞型的表達，發(fā)現(xiàn)整合素αⅤβ3在DAF-G 2D中表達顯著上調(diào)，并導(dǎo)致下游的RhoA活性增強(圖5c)。有研究表明，整合素αⅤβ3的活化能夠增強Ⅰ型膠原的表達，從而有利于AF分化。而細胞骨架介導(dǎo)的Rho-GTP酶通過參與LATS1/2去磷酸化使YAP1分子活化以應(yīng)答受整合素轉(zhuǎn)化。蛋白質(zhì)印跡表征顯示LATS的磷酸化程度在DAF-G 2D中明顯降低，說明Hippo通路未被激活，YAP1的磷酸化也因此下調(diào)并伴隨YAP1退化的減弱(圖5d)。上述結(jié)果說明，DAF-G 2D 的組成和空間特征激活了整合素αⅤβ3，促進了肌動蛋白相關(guān)的Rho-GTP酶的酶促反應(yīng)，并導(dǎo)致了LATS介導(dǎo)的YAP1的去磷酸化(即活化)。接下來，研究人員分析了DNP-G 3D中YAP1的活性抑制機理。

圖5 整合素αⅤβ3/RhoA/LATS/YAP1信號通路作用DTM誘導(dǎo)的組織特異性分化

4. YAP1對hBMSCs組織特異性分化的相反調(diào)控效應(yīng)

從上面的分析可以看出，DAF-G 2D培養(yǎng)能抑制YAP1磷酸化從而提高它的活性。相反地，DNP-G 3D培養(yǎng)不僅能促進YAP1磷酸化(從而降低其活性)，還使YAP1從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)(圖6a-c)，并伴隨其目標蛋白質(zhì)的下調(diào)。為了進一步確定YAP1在NP分化中的重要作用，研究人員發(fā)現(xiàn)當YAP1活性被抑制時，NP標志物(GPC3和其他)的表達顯著提高(圖6d-e)，說明抑制YAP1能夠促進hBMSCs向NP細胞分化。而當研究人員以轉(zhuǎn)染方式過表達YAP1時，發(fā)現(xiàn)GPC3和其他NP標志物的表達均下降了(圖6f-g)。所以，YAP1磷酸化(即活性抑制)及其向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移促進了hBMSCs向NP細胞分化。另一方面，DAF-G 2D培養(yǎng)時，YAP1的表達水平(細胞核內(nèi))最高而磷酸化YAP1(p-YAP1)的表達水平低于其他組(圖6h-j)，而且轉(zhuǎn)錄水平也提高了。進一步地，當YAP1活性被抑制時，研究人員發(fā)現(xiàn)AF標志物表達水平被下調(diào)了(圖6k-i)，說明抑制YAP1活性能阻礙hBMSCs向AF細胞分化。而當YAP1過表達時，AF標志物TNMD的表達被上調(diào)了，說明YAP1的表達上調(diào)及其向細胞核轉(zhuǎn)移導(dǎo)致了hBMSCs向AF細胞分化。

研究人員對YAP1的核質(zhì)分布也進行了分析，認為YAP1在DAF-G 2D的核內(nèi)聚集的原因除了培養(yǎng)方式還有機械因素(DAF-G的儲能模量高于DNP-G)。轉(zhuǎn)錄組RNA測序顯示低模量會伴隨YAP1的退化，表明較軟的基底能增加NP細胞表型。除了機械因素，DTM的組成差異也能影響YAP1的胞內(nèi)分布。例如，存在于DAF-G中的 TGF-β1能夠通過PI3K/Akt信號通路調(diào)控YAP1活化，而YAP1目標基因亞型主要取決于內(nèi)源TGF-β1信號通路。因此，DAF-G 2D中TGF-β1高表達有助于YAP1的活化。另一方面，存在于DNP-G中的FGF-2在低濃度時能夠誘導(dǎo)YAP1向細胞核聚集，而高濃度時則能激活Hippo通路并促進YAP1失活。

圖6 YAP1對hBMSCs組織特異性分化的相反調(diào)控效應(yīng)

5.DTM水凝膠的組織特異性修復(fù)
為了考察DNP-G是否能夠更好地治療NP退化疾病，研究人員將不同水凝膠注射到大鼠模型中NP退化的病變部位。受傷NP組織的修復(fù)程度通過術(shù)后4周和8周的病理學(xué)和形態(tài)學(xué)分析進行評價。MRI表征顯示DNP-G能更好地保持NP組織的完整性(圖7a)，而水含量定量分析和普菲爾曼分級顯示DNP-G具有最佳的修復(fù)效果(圖7b-c)。H&E和S&O染色表征顯示DNP-G顯著減輕了NP組織的形態(tài)學(xué)惡化(圖7d-e)。X-ray結(jié)果顯示DNP-G組中椎間盤高度能更好地維持，顯著減輕了椎間盤窄化的不良現(xiàn)象(圖7f)。COL1A1和COL2A1的免疫組化染色顯示8周時DNP-G組中的COL2A1陽性染色面積明顯大于其他組(圖7g)。上述結(jié)果說明DNP-G能夠有效地修復(fù)受傷的NP組織并阻止其退化。

另一方面，研究人員采用大鼠AF缺陷模型評估了DAF-G的組織特異性修復(fù)功能。MRI表征顯示DAF-G具有最高的T2加權(quán)信號、水含量和最低的普菲爾曼評分，說明椎間盤退化被顯著延遲了。H&E和S&O染色表征顯示，DAF-G和DNP-G組的椎間盤組織在術(shù)后4周時沒有出現(xiàn)退化形態(tài)，而對照組則出現(xiàn)了低細胞存活量、低蛋白聚糖含量和不規(guī)則的ECM分布(圖8a)。術(shù)后12周，DAF-G組的退化得到了更大程度上的減輕，而且殘留AF膠原取向性較好(圖8a)。COL1A1染色顯示，相比于DAF-G組，AF缺陷在DNP-G和NS組仍然明顯，說明DAF-G能更好地連接周圍組織。另外，DAF-G組的COL2A1陽性染色面積明顯大于其他組(圖8b)。定量組織學(xué)分級表征顯示，DAF-G組中的損傷椎間盤的修復(fù)程度最高�？傊�，這些結(jié)果表明組織特異性的DTM水凝膠能夠在體內(nèi)修復(fù)他們對應(yīng)的組織損傷和缺陷。

圖7 DNP-G特異性修復(fù)NP組織

圖8 DAF-G特異性修復(fù)AF組織

總結(jié)
在這篇論文中，研究人員對利用椎間盤兩塊相鄰但不同的組織系統(tǒng)研究了DTM水凝膠對干細胞行為(分化)的組織特異性影響。主要結(jié)論包括三點：①DNP-G和DAF-G誘導(dǎo)hBMSCs分別向NP和AF細胞的組織特異性分化取決于細胞的天然ECM組成和空間特征；②調(diào)控整合素介導(dǎo)的RhoA/LATS /YAP1信號通路能夠決定hBMSCs的命運；③DNP-G和DAF-G能特異性地體內(nèi)修復(fù)對應(yīng)組織損傷和缺陷。研究人員還指出，基于水凝膠材料強大的可塑性，生物3D打印、靜電紡絲、相分離和其他加工方法都可被用來構(gòu)建NP和AF空間結(jié)構(gòu)并保留功能性ECM組成，從而為修復(fù)退化NP和AF組織提供有效的治療策略。

參考文獻
Y. Peng et al., Decellularized Disc Hydrogels for hBMSCs tissue-specific differentiation and tissue regeneration. Bioactive Materials 6, 3541-3556 (2021). DOI：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2021.03.014