脫細(xì)胞椎間盤水凝膠對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的組織特異性分化和再生研究

來源：生物打印與再生工程

細(xì)胞行為與其所處的微環(huán)境密切相關(guān)。不同組織呈現(xiàn)給駐留細(xì)胞的微環(huán)境也不盡相同，因而存在組織特異性。深入研究組織特異性與細(xì)胞行為的內(nèi)在聯(lián)系對(duì)于體外調(diào)控細(xì)胞行為和體內(nèi)組織修復(fù)具有重要的指導(dǎo)意義。近日，來自華中科技大學(xué)的Shao Zengwu & Lei Ming和中山大學(xué)的Quan Daping團(tuán)隊(duì)通過將椎間盤內(nèi)兩塊相鄰的不同組織脫細(xì)胞并制成水凝膠，系統(tǒng)研究了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在其中的組織特異性分化。研究發(fā)現(xiàn)，這種組織特異性分化不僅依賴于脫細(xì)胞組織基質(zhì)的材料組成，還與其培養(yǎng)方式(2D還是3D)相關(guān)。通過對(duì)RhoA/LATS/YAP1信號(hào)通路的系統(tǒng)分析，研究人員發(fā)現(xiàn)YAP1的調(diào)控在組織特異性分化中具有重要作用。最后，研究人員評(píng)估了組織特異性在組織再生中的積極作用。

椎間盤退化(IDD)是影響骨骼肌系統(tǒng)功能的常見疾病之一�，F(xiàn)有的臨床治療手段如手術(shù)治療、局部封堵和保守治療效果欠佳，亟需開發(fā)新的治療策略。最近數(shù)十年，基于生物機(jī)械修復(fù)機(jī)制的生物材料治療引起了研究人員的極大興趣。用于椎間盤修復(fù)的主要生物材料包括不可降解的聚丙烯酸酯和聚丙烯酰胺以及可降解的透明質(zhì)酸、膠原和殼聚糖。然而，這些植入材料往往不能很好地調(diào)控傷口微環(huán)境、組織退化、水分流失和炎癥反應(yīng)。到目前為止，利用生物材料實(shí)現(xiàn)椎間盤再生和恢復(fù)組織完整性還未取得令人滿意的臨床結(jié)果。

治療IDD的另一種思路是細(xì)胞療法�；�于干細(xì)胞的細(xì)胞療法在治療IDD上已經(jīng)取得了一些有益的結(jié)果。例如，體內(nèi)注射間充質(zhì)干細(xì)胞并將其分化為椎間盤細(xì)胞促進(jìn)了椎間盤組織細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成。然而，由于缺乏適宜的細(xì)胞載體材料，這種方法面臨的最直接問題是低細(xì)胞存活率和干細(xì)胞分化不可控。大量研究表明，脫細(xì)胞組織基質(zhì)(DTM)去除了免疫原性而保留了原有組織的大部分功能性成分(如細(xì)胞因子、基質(zhì)結(jié)合納米囊泡和蛋白)和3D超微結(jié)構(gòu)，是一種理想的細(xì)胞載體材料。其中，DTM水凝膠不僅能夠作為細(xì)胞的物理載體，還能通過其組織特異性調(diào)控細(xì)胞行為。椎間盤的主要功能構(gòu)成包括髓核(NP)核纖維環(huán)(AF)，而這兩種相鄰組織在組成和結(jié)構(gòu)上存在差異。于是，研究人員提出一個(gè)問題：這種組織差異性能否特異性地誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向?qū)��?yīng)的組織進(jìn)行分化？

另一方面，研究人員也注意到了細(xì)胞微環(huán)境的空間特征對(duì)干細(xì)胞行為的影響。例如，3D環(huán)境可提供額外的刺激以促進(jìn)成骨分化。對(duì)于肌成纖維細(xì)胞的分化，2D和3D培養(yǎng)存在巨大差異。因?yàn)镹P細(xì)胞和AF細(xì)胞在體內(nèi)具有不同的空間特征，因此在研究干細(xì)胞的組織特異性分化時(shí)兼顧培養(yǎng)方式的影響也十分有必要。

在這篇論文中，研究人員首先制備了脫細(xì)胞髓核和纖維環(huán)以及對(duì)應(yīng)的水凝膠(DNP-G和DAF-G)，并評(píng)估了脫細(xì)胞工藝和表征了水凝膠的基本性能。然后，研究人員利用蛋白組學(xué)工具分析了兩種水凝膠的組成異同，并確定了差異組成和特異性標(biāo)志物。緊接著，研究人員分別研究了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)在不同的水凝膠材料中的特異性分化。為弄清楚組織特異性分化的具體機(jī)制，研究人員對(duì)整合素介導(dǎo)的Rho/LATS/YAP1信號(hào)通路進(jìn)行了重點(diǎn)分析。最后，研究人員還評(píng)估了這兩種水凝膠在大鼠椎間盤模型中的組織特異性再生功能。圖1給出了大致的研究思路和內(nèi)容。

圖1 DTM制備過程和體內(nèi)外應(yīng)用示意圖

1.脫細(xì)胞及DNP-G和DAF-G的制備和表征
研究人員首先評(píng)估了脫細(xì)胞工藝。H&E染色和DAPI染色表明大部分細(xì)胞成分已被去除，而且殘留DNA含量也降低至國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)(50 ng/mg)以下，表明使用脫細(xì)胞工藝的有效性(圖2a-c)。同時(shí)，在脫細(xì)胞過程中ECM主要成分膠原和糖胺聚糖(GAGs)得到了很好的保留(圖2d-e)。掃描電鏡(SEM)顯示兩種不同的DTM具有不同的微觀結(jié)構(gòu)：DAF的納米纖維結(jié)構(gòu)取向性和直徑略高于DNP(圖2f)。流變表征顯示，DAF-G比DNP-G有更短的凝膠時(shí)間和更高的儲(chǔ)能模量(圖2g)。然后，研究人員利用蛋白質(zhì)學(xué)分析確定了兩種DTM蛋白組成和成分差異(圖2h-i)�；�于基因本體(GO)數(shù)據(jù)庫的分子功能(MF)分析表明，DNP-G中的蛋白質(zhì)豐度更高，并與GAGs結(jié)合、蛋白二聚活性、催化活性、結(jié)構(gòu)分子活性和糖類衍生物結(jié)合等相關(guān)(圖2j)。細(xì)胞活死染色和CCK8試驗(yàn)表明DNP-G和DAF-G均具有良好的細(xì)胞相容性，而皮下異種移植模型實(shí)驗(yàn)表明兩種DTM引起的炎癥反應(yīng)不明顯。

圖2 DNP-G和DAF-G的成分差異、形貌和流變性能表征和蛋白組學(xué)分析

2. DNP-G和DAF-G對(duì)hBMSCs的定向分化

為了區(qū)分NP和AF兩種細(xì)胞，研究人員首先確定了對(duì)應(yīng)的特異性標(biāo)志物。在研究DTM水凝膠對(duì)hBMSCs的定向分化之前，研究人員先考察了DTM溶液對(duì)hBMSCs定向分化的影響(Ⅰ型膠原為對(duì)照組)。通過S&O染色和免疫組織化分析，研究人員發(fā)現(xiàn)NP特異性標(biāo)志物(CD24和COL2A1)的陽性染色在DNP組中更明顯，而AF特異性標(biāo)志物(COL1A1和TNMD)的陽性染色在DAF組中更明顯(圖3a)。上述結(jié)果說明DNP和DAF溶液具有誘導(dǎo)hBMSCs定向分化為NP何AF細(xì)胞的潛力。為進(jìn)一步驗(yàn)證這種組織特異性分化，研究人員分析了特異性標(biāo)志物在不同水凝膠和不同培養(yǎng)條件(2D和3D)下的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)3D培養(yǎng)21天后NP標(biāo)志物(COL2A1，CD24，KRT19，ACAN和NCAM1)在DNP-G中表達(dá)上調(diào)(圖3b)。另外，免疫熒光染色、蛋白質(zhì)印跡和灰度分析顯示NP標(biāo)志物GPC3的熒光強(qiáng)度和表達(dá)量強(qiáng)于其他組，特別是在3D培養(yǎng)環(huán)境下(圖3c-d)。通過對(duì)比2D和3D培養(yǎng)環(huán)境下NP標(biāo)志物的表達(dá)，研究人員發(fā)現(xiàn)DNP-G在3D環(huán)境下更能促進(jìn)hBMSCs向NP分化(圖3e)�；�于蛋白組學(xué)的分析，研究人員推測(cè)這可能與DNP中的FGF18有關(guān)。FGFG18能夠通過上調(diào)ACAN和COL2A1表達(dá)以促進(jìn)軟骨分化。另外，DNP除了含有多種生長(zhǎng)因子外，還包含豐富的膠原如COL2A1、COL11A2和COL9A3。其中，Ⅱ型膠原能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向NP分化。另一方面，健康的NP組織高度水合，從而在椎間盤發(fā)育過程中將NP細(xì)胞包裹在類似凝膠的微環(huán)境中。所以，DNP-G以3D方式培養(yǎng)hBMSCs更有助于其向NP細(xì)胞分化。

不同的是，DAF-G誘導(dǎo)hBMSCs向AF分化，特別是在2D環(huán)境下(圖4a)，而且2D培養(yǎng)下AF標(biāo)志物TNMD的表達(dá)高于其他組(圖4b-c)。對(duì)比2D和3D培養(yǎng)環(huán)境，hBMSCs在DAF-G 2D環(huán)境下能表達(dá)更多的AF標(biāo)志物(圖4d)。同樣是基于蛋白組學(xué)分析，研究人員認(rèn)為這與DAF中的TGF-β1有關(guān)，因?yàn)門GF-β1是一個(gè)維持AF細(xì)胞表型的有效因子(雖然它也能誘導(dǎo)NP分化)。另外，DAF-G中存在的Ⅰ型膠原能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的AF分化。另一方面，天然AF組織具有層狀結(jié)構(gòu)特征，迫使AF細(xì)胞以伸展的形態(tài)嵌在片層之間，相當(dāng)于AF細(xì)胞接種在基底表面。所以，DAF-G以2D培養(yǎng)hBMSCs有助于其向AF細(xì)胞分化。以上結(jié)果說明hBMSCs的組織特異性分化不僅取決于DTM的組成，還受其空間特征(培養(yǎng)方式)的影響。

圖3 DNP-G 3D培養(yǎng)誘導(dǎo)hBMSCs向NP細(xì)胞分化

圖4 DAF-G 2D誘導(dǎo)hBMSCs向AF細(xì)胞分化

3. DAF-G 2D激活整合素介導(dǎo)的RhoA/LATS/YAP1信號(hào)通路

整合素轉(zhuǎn)導(dǎo)的Hippo/YAP1信號(hào)通路通過感知細(xì)胞粘附并將機(jī)械信號(hào)從胞外傳遞至胞內(nèi)受體以調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)。然而，上述信號(hào)通路在DNP-G和DAF-G的組織和空間特異性中的具體作用還未被確定。研究人員首先利用免疫熒光染色表征了細(xì)胞的粘附特性，發(fā)現(xiàn)在DAF-G 2D培養(yǎng)條件下hBMSCs具有更大的細(xì)胞覆蓋面積和黏著斑面積，說明DAF-G 2D能顯著增強(qiáng)細(xì)胞-ECM粘附(圖5a-b)。接下來，研究人員考察了4個(gè)整合素亞型的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)整合素αⅤβ3在DAF-G 2D中表達(dá)顯著上調(diào)，并導(dǎo)致下游的RhoA活性增強(qiáng)(圖5c)。有研究表明，整合素αⅤβ3的活化能夠增強(qiáng)Ⅰ型膠原的表達(dá)，從而有利于AF分化。而細(xì)胞骨架介導(dǎo)的Rho-GTP酶通過參與LATS1/2去磷酸化使YAP1分子活化以應(yīng)答受整合素轉(zhuǎn)化。蛋白質(zhì)印跡表征顯示LATS的磷酸化程度在DAF-G 2D中明顯降低，說明Hippo通路未被激活，YAP1的磷酸化也因此下調(diào)并伴隨YAP1退化的減弱(圖5d)。上述結(jié)果說明，DAF-G 2D 的組成和空間特征激活了整合素αⅤβ3，促進(jìn)了肌動(dòng)蛋白相關(guān)的Rho-GTP酶的酶促反應(yīng)，并導(dǎo)致了LATS介導(dǎo)的YAP1的去磷酸化(即活化)。接下來，研究人員分析了DNP-G 3D中YAP1的活性抑制機(jī)理。

圖5 整合素αⅤβ3/RhoA/LATS/YAP1信號(hào)通路作用DTM誘導(dǎo)的組織特異性分化

4. YAP1對(duì)hBMSCs組織特異性分化的相反調(diào)控效應(yīng)

從上面的分析可以看出，DAF-G 2D培養(yǎng)能抑制YAP1磷酸化從而提高它的活性。相反地，DNP-G 3D培養(yǎng)不僅能促進(jìn)YAP1磷酸化(從而降低其活性)，還使YAP1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)(圖6a-c)，并伴隨其目標(biāo)蛋白質(zhì)的下調(diào)。為了進(jìn)一步確定YAP1在NP分化中的重要作用，研究人員發(fā)現(xiàn)當(dāng)YAP1活性被抑制時(shí)，NP標(biāo)志物(GPC3和其他)的表達(dá)顯著提高(圖6d-e)，說明抑制YAP1能夠促進(jìn)hBMSCs向NP細(xì)胞分化。而當(dāng)研究人員以轉(zhuǎn)染方式過表達(dá)YAP1時(shí)，發(fā)現(xiàn)GPC3和其他NP標(biāo)志物的表達(dá)均下降了(圖6f-g)。所以，YAP1磷酸化(即活性抑制)及其向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移促進(jìn)了hBMSCs向NP細(xì)胞分化。另一方面，DAF-G 2D培養(yǎng)時(shí)，YAP1的表達(dá)水平(細(xì)胞核內(nèi))最高而磷酸化YAP1(p-YAP1)的表達(dá)水平低于其他組(圖6h-j)，而且轉(zhuǎn)錄水平也提高了。進(jìn)一步地，當(dāng)YAP1活性被抑制時(shí)，研究人員發(fā)現(xiàn)AF標(biāo)志物表達(dá)水平被下調(diào)了(圖6k-i)，說明抑制YAP1活性能阻礙hBMSCs向AF細(xì)胞分化。而當(dāng)YAP1過表達(dá)時(shí)，AF標(biāo)志物TNMD的表達(dá)被上調(diào)了，說明YAP1的表達(dá)上調(diào)及其向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移導(dǎo)致了hBMSCs向AF細(xì)胞分化。

研究人員對(duì)YAP1的核質(zhì)分布也進(jìn)行了分析，認(rèn)為YAP1在DAF-G 2D的核內(nèi)聚集的原因除了培養(yǎng)方式還有機(jī)械因素(DAF-G的儲(chǔ)能模量高于DNP-G)。轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序顯示低模量會(huì)伴隨YAP1的退化，表明較軟的基底能增加NP細(xì)胞表型。除了機(jī)械因素，DTM的組成差異也能影響YAP1的胞內(nèi)分布。例如，存在于DAF-G中的 TGF-β1能夠通過PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控YAP1活化，而YAP1目標(biāo)基因亞型主要取決于內(nèi)源TGF-β1信號(hào)通路。因此，DAF-G 2D中TGF-β1高表達(dá)有助于YAP1的活化。另一方面，存在于DNP-G中的FGF-2在低濃度時(shí)能夠誘導(dǎo)YAP1向細(xì)胞核聚集，而高濃度時(shí)則能激活Hippo通路并促進(jìn)YAP1失活。

圖6 YAP1對(duì)hBMSCs組織特異性分化的相反調(diào)控效應(yīng)

5.DTM水凝膠的組織特異性修復(fù)
為了考察DNP-G是否能夠更好地治療NP退化疾病，研究人員將不同水凝膠注射到大鼠模型中NP退化的病變部位。受傷NP組織的修復(fù)程度通過術(shù)后4周和8周的病理學(xué)和形態(tài)學(xué)分析進(jìn)行評(píng)價(jià)。MRI表征顯示DNP-G能更好地保持NP組織的完整性(圖7a)，而水含量定量分析和普菲爾曼分級(jí)顯示DNP-G具有最佳的修復(fù)效果(圖7b-c)。H&E和S&O染色表征顯示DNP-G顯著減輕了NP組織的形態(tài)學(xué)惡化(圖7d-e)。X-ray結(jié)果顯示DNP-G組中椎間盤高度能更好地維持，顯著減輕了椎間盤窄化的不良現(xiàn)象(圖7f)。COL1A1和COL2A1的免疫組化染色顯示8周時(shí)DNP-G組中的COL2A1陽性染色面積明顯大于其他組(圖7g)。上述結(jié)果說明DNP-G能夠有效地修復(fù)受傷的NP組織并阻止其退化。

另一方面，研究人員采用大鼠AF缺陷模型評(píng)估了DAF-G的組織特異性修復(fù)功能。MRI表征顯示DAF-G具有最高的T2加權(quán)信號(hào)、水含量和最低的普菲爾曼評(píng)分，說明椎間盤退化被顯著延遲了。H&E和S&O染色表征顯示，DAF-G和DNP-G組的椎間盤組織在術(shù)后4周時(shí)沒有出現(xiàn)退化形態(tài)，而對(duì)照組則出現(xiàn)了低細(xì)胞存活量、低蛋白聚糖含量和不規(guī)則的ECM分布(圖8a)。術(shù)后12周，DAF-G組的退化得到了更大程度上的減輕，而且殘留AF膠原取向性較好(圖8a)。COL1A1染色顯示，相比于DAF-G組，AF缺陷在DNP-G和NS組仍然明顯，說明DAF-G能更好地連接周圍組織。另外，DAF-G組的COL2A1陽性染色面積明顯大于其他組(圖8b)。定量組織學(xué)分級(jí)表征顯示，DAF-G組中的損傷椎間盤的修復(fù)程度最高�？傊�，這些結(jié)果表明組織特異性的DTM水凝膠能夠在體內(nèi)修復(fù)他們對(duì)應(yīng)的組織損傷和缺陷。

圖7 DNP-G特異性修復(fù)NP組織

圖8 DAF-G特異性修復(fù)AF組織

總結(jié)
在這篇論文中，研究人員對(duì)利用椎間盤兩塊相鄰但不同的組織系統(tǒng)研究了DTM水凝膠對(duì)干細(xì)胞行為(分化)的組織特異性影響。主要結(jié)論包括三點(diǎn)：①DNP-G和DAF-G誘導(dǎo)hBMSCs分別向NP和AF細(xì)胞的組織特異性分化取決于細(xì)胞的天然ECM組成和空間特征；②調(diào)控整合素介導(dǎo)的RhoA/LATS /YAP1信號(hào)通路能夠決定hBMSCs的命運(yùn)；③DNP-G和DAF-G能特異性地體內(nèi)修復(fù)對(duì)應(yīng)組織損傷和缺陷。研究人員還指出，基于水凝膠材料強(qiáng)大的可塑性，生物3D打印、靜電紡絲、相分離和其他加工方法都可被用來構(gòu)建NP和AF空間結(jié)構(gòu)并保留功能性ECM組成，從而為修復(fù)退化NP和AF組織提供有效的治療策略。

參考文獻(xiàn)
Y. Peng et al., Decellularized Disc Hydrogels for hBMSCs tissue-specific differentiation and tissue regeneration. Bioactive Materials 6, 3541-3556 (2021). DOI：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2021.03.014