助力3D生物打印：基于脫細(xì)胞基質(zhì)生物墨水的3D打印真皮研發(fā)新成果 ——皮膚創(chuàng)傷患者...

助力3D生物打�。夯�于脫細(xì)胞基質(zhì)生物墨水的3D打印真皮研發(fā)新成果——皮膚創(chuàng)傷患者的希望

背景介紹

燒傷作為第四大最常見的皮膚創(chuàng)傷誘因，除休克和敗血癥外，皮膚創(chuàng)傷處繼續(xù)生長和收縮的瘢痕也是燒傷最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，它不僅會損害患者的外貌，還會嚴(yán)重影響患者的生理及心理健康。防止瘢痕收縮最先進(jìn)手段包括早期移植或皮瓣轉(zhuǎn)移。然而，此類治療可能會導(dǎo)致供體或皮瓣部位瘢痕攣縮，并且常常受到皮膚/皮瓣來源不足等因素制約。因此，臨床實施困難重重。雖然已有部分研究報道結(jié)合3D打印及生物墨水制備皮膚類似物用于皮膚創(chuàng)傷修復(fù)并已取得很好的實驗結(jié)果，但目前的研究大多集中在體外材料介導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)， 而非宏觀的傷口愈合過程， 且該類生物材料在抑制瘢痕攣縮方面的作用目前尚無足夠的證據(jù)和結(jié)論進(jìn)行支撐， 因此探索新型真皮材料的研發(fā)及復(fù)合生物3D打印技術(shù)將為提高患者皮膚創(chuàng)面修復(fù)質(zhì)量帶來新的希望。

近日，一篇名為“3D-printed dermis-specific extracellular matrix mitigates scar contraction via inducing early angiogenesis and macrophage M2 polarization”關(guān)于皮膚表面創(chuàng)傷修復(fù)的文章由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院燒傷外科祁少海教授研究團(tuán)隊和中山大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院陳永明教授團(tuán)隊共同在生物醫(yī)學(xué)1區(qū)及生物材料1區(qū)期刊Bioactive Materials發(fā)表。

該研究團(tuán)隊從具備多年臨床應(yīng)用經(jīng)驗的豬真皮細(xì)胞外基質(zhì)材料入手， 制備了可以高效保留豬真皮層細(xì)胞外基質(zhì)主要成分的的生物活性粉末， 并利用此粉末制備了可供生物3D打印的溫敏墨水。該團(tuán)隊使用此墨水， 通過擠出式3D打印方式， 制備出了具有百微米級別空間構(gòu)型的皮膚真皮結(jié)構(gòu)類似物（PDA）。 實驗結(jié)果表明該3D打印制備的真皮類似物具有良好的生物相容性， 可有效促進(jìn)植皮后的早期血管化， 更有意義的是能夠通過調(diào)節(jié)皮膚再生相關(guān)基因的表達(dá)從而有效抑制植皮創(chuàng)面攣縮而帶來的瘢痕影響。

實驗結(jié)果

1.        豬真皮細(xì)胞外基質(zhì)超細(xì)粉末（dECM）的制備與表征

首先，通過DAPI、Massons染色和甲苯胺藍(lán)染色等實驗方法證明可通過機(jī)械破碎方式獲得具有組織特異性的超微細(xì)胞外基質(zhì)粉末和影響局部細(xì)胞行為的功能性分子， 如糖胺聚糖（GAGs）等。

2.        利用3D打印技術(shù)制備體外皮膚類似物（PDA）

通過流變學(xué)測試優(yōu)化并確定了包括打印溫度（18-20°C），墨水濃度（8.5wt%），打印速率（50mm/min）在內(nèi)的打印參數(shù)，利用3D打印方式制備體外皮膚類似物（PDA）。3D打印構(gòu)建的類皮膚結(jié)構(gòu)經(jīng)戊二醛交聯(lián)后進(jìn)行了體外降解及細(xì)胞毒性實驗。實驗結(jié)果表明，經(jīng)化學(xué)交聯(lián)的PDA在體外降解56天時依然保持良好的結(jié)構(gòu)完整性。通過在PDA表面接種L929成纖維細(xì)胞，通過細(xì)胞活/死染色和MTT檢測均證明此PDA具有良好的生物相容性。

3.        體內(nèi)實驗-皮膚傷口移植收縮評估

使用大鼠全皮層創(chuàng)傷模型評價PDA對分層厚皮移植（STSG）中傷口愈合及收縮的評估。實驗結(jié)果證明PDA在減少疤痕收縮和促進(jìn)傷口愈合效果方面優(yōu)于作為陽性對照 （PL）的售類真皮產(chǎn)品Pelnac®。

4.        皮膚移植物術(shù)后變化及基因分析

通過不同時間點采集的皮膚移處切片經(jīng)組織染色表征，發(fā)現(xiàn)PDA可有效減輕傷口纖維化，并在促進(jìn)膠原沉積成熟的同時對受損毛囊、皮脂腺等附屬器官也有一定的修復(fù)。與此同時，通過對代謝和信號通路基因追蹤發(fā)現(xiàn)并確定了PL組和PDA組動物創(chuàng)傷表型的差異是由材料介導(dǎo)的創(chuàng)傷細(xì)胞在遺傳水平上的一系列變化引起的。

5.        皮膚移植血管新生分析

研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚植入早期，功能性的新血管產(chǎn)生與移植皮膚類似物的正常機(jī)理維持有關(guān)，新血管的形成可以防止瘢痕形成和相關(guān)部委皮膚收縮。本實驗中，通過鏡下觀察移植物周邊微血管密度和相關(guān)基因數(shù)據(jù)判斷移植物植入術(shù)后的存活情況。在術(shù)后，PDA組微血管數(shù)呈現(xiàn)先增加后減緩的趨勢，與此同時，誘導(dǎo)新血管生成，且能促進(jìn)肝纖維化的Grem1基因檢測顯示PL組中參與新血管形成的相關(guān)信號通路相關(guān)基因呈上調(diào)趨勢，與組織學(xué)結(jié)果一致。

6.        手術(shù)部位巨噬細(xì)胞極化

皮膚受傷后會引起一系列的炎癥反應(yīng)，在所有參與這一反應(yīng)的免疫細(xì)胞中，mϕ表型(M1趨向M2)的轉(zhuǎn)化不僅是傷口修復(fù)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵條件，也是材料-新生組織整合及瘢痕形成的關(guān)鍵因素。通過免疫組化CD68、CRR7、CD163對各區(qū)段的巨噬細(xì)胞m ϕ表型進(jìn)行免疫染色評價。實驗結(jié)果表明，自第14天起，PDA移植創(chuàng)面中M2比例明顯高于IS和PL移植創(chuàng)面，表明的傷口有助于為再上皮化和從肉芽組織發(fā)育為特征的修復(fù)階段向穩(wěn)定階段過渡。

結(jié)論

本文報道了一種新穎的用豬真皮脫細(xì)胞基質(zhì)3D打印組裝PDA移植物的抗瘢痕方法，移植PDA可以顯著減少創(chuàng)面收縮和瘢痕形成， 同時PDA植入組表現(xiàn)出高效的早期血管重建，巨噬細(xì)胞向M2表型的極化增強(qiáng)，皮膚功能保存較好的修復(fù)效應(yīng)，其修復(fù)結(jié)果與正常皮膚形態(tài)學(xué)相似。本研究通過分子生物學(xué)進(jìn)一步闡述了移植物在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)、瘢痕形成上的基因調(diào)控機(jī)理， 同時未來生物材料對皮膚抗瘢痕特性的改善及其臨床可譯性奠定了一定基礎(chǔ)。

Chen L, Li Z, Zheng Y, Zhou F, Zhao J, Zhai Q, et al. 3D-printed dermis-specific extracellular matrix mitigates scar contraction via inducing early angiogenesis and macrophage M2 polarization. Bioactive Materials 2022;10:236-46.

https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2021.09.008