利用3D打印技術(shù)制備用于培育肉生產(chǎn)的豬骨骼肌組織

來源: 食品科學雜志  

培育肉由體外動物細胞培養(yǎng)發(fā)展而來，采用可控的細胞增殖、定向分化、收集和加工，代表了食品的未來。與傳統(tǒng)的肉類生產(chǎn)相比，培育肉是在無菌實驗室/工廠中生產(chǎn)的，是清潔、安全且可持續(xù)的。此外，與普通肉（或植物蛋白肉）不同，培育肉含有真正的動物蛋白，具有廣闊的市場前景。作為一種新興食品，培育肉在食用、感官、安全、營養(yǎng)和價格方面受到廣泛關注。

培育肉生產(chǎn)包括動物細胞分離、體外細胞擴增、細胞定向分化、三維（3D）培養(yǎng)、最終獲取纖維和食品加工。這一過程的目的是用少數(shù)細胞重建牲畜肌肉的復雜結(jié)構(gòu)。然而，由于實驗室中通常使用的培養(yǎng)皿只能實現(xiàn)二維單層細胞培養(yǎng)，因此可以利用組織工程構(gòu)建使用支架材料的3D培養(yǎng)系統(tǒng)，以更好地模仿體內(nèi)的生長環(huán)境。

3D生物打印技術(shù)被廣泛應用于組織工程領域。對于培育肉生產(chǎn)，3D生物打印技術(shù)提供了一種從肌肉細胞獲得組織結(jié)構(gòu)的有效途徑。由于生物墨水攜帶細胞并支撐結(jié)構(gòu)，它們必須具有良好的機械性能和生物兼容性，這是3D生物打印的關鍵挑戰(zhàn)。這些特性決定了3D結(jié)構(gòu)的精度和細胞的活性。

由于水凝膠的高含水量、物理結(jié)構(gòu)、機械性能和3D網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，目前是首選的生物墨水。水凝膠還可以模仿細胞周圍的細胞外基質(zhì)，為細胞生長提供有利的環(huán)境，并使細胞間相互作用和生化信號交換成為可能。各種天然水凝膠材料常用于3D生物打印系統(tǒng)，也廣泛用于食品工業(yè)，如海藻酸鹽和明膠作為食品添加劑，膠原蛋白作為外殼原料，以及絲素蛋白用于食用包裝材料。

海藻酸鹽是最常用的離子交聯(lián)生物墨水，其特點是成型和機械性能好，與鈣離子的離子固化能力強，生物相容性差。明膠-甲基丙烯酸酯（GelMA）是一種改性明膠，其溶液可以用紫外線或可見光固化成膠水；具有可打印性和可成型性的優(yōu)點，但其生物相容性和機械性能仍有待優(yōu)化。絲素蛋白價格低廉，具有良好的生物相容性，但機械性能較差。單一的天然凝膠材料不能完全滿足一個好的生物墨水的特性；不同生物墨水的組合可以使它們各自的優(yōu)勢得到發(fā)揮。

在這項研究中， 中國肉類食品綜合研究中心的李瑩瑩、王守偉等 開發(fā)了兩種復合水凝膠生物墨水，即離子固化的海藻酸-明膠水凝膠（AG）和光固化的GelMA-絲素蛋白水凝膠（GS），用于構(gòu)建培育肉的3D骨骼肌組織。通過改變不同比例的水凝膠生物墨水的打印特性，選擇了最佳的生物墨水來構(gòu)建豬骨骼肌衛(wèi)星細胞（PMSCs）3D培養(yǎng)系統(tǒng)，以制備能夠最好地模仿體內(nèi)肌肉狀態(tài)的肌肉組織，從而克服了由于PMSCs在體外的貼壁生長而導致的培育肉中小構(gòu)件的限制。


生物墨水的選擇和優(yōu)化
流變行為
研究了AGs 1～4和GSs 0～2的流變學特性（圖1）。隨著溫度的升高，AG和GS的儲能模量（G'）和耗能模量（G''）不斷下降，但G'總是高于G''，并且存在交點，這表明溫度可以改變水凝膠狀態(tài)。本研究中凝膠溫度不同，AGs 1～4的溫度分別為27.5、28.5、29.5、33.0 ℃，而GSs 0～2的溫度分別為30.0、27.5、26.5 ℃。在AG中，由于明膠對溫度的敏感性，明膠溫度隨著明膠含量的增加而增加。在GS中，由于絲素蛋白的高溶解度，凝膠溫度隨著絲素蛋白含量的增加而降低。

圖1 不同水凝膠配方中作為溫度函數(shù)的流變特性

每種水凝膠的黏度隨著剪切率的增加而降低，表明所有的生物墨水都是具有剪切稀化特性的非牛頓流體，這有利于打印過程中的擠壓。然而，不同生物墨水的黏度不同，AG3和AG4在100 rad/s時的黏度為9～7000 Pa·s，GS1和GS2在100 rad/s時的黏度為0.1～10 Pa·s�？刂拼蛴�溫度需要同時考慮到凝膠溫度和黏度，使每個生物墨水在打印開始時保持一個良好的溶液或膠體狀態(tài)。連續(xù)的擠壓力可以確保生物材料的纖維順利和連續(xù)地被擠壓出來。此外，在凝膠溫度下，所有組的tanδ值都小于1，表明每種生物墨水都趨于彈性，這種固體的特性可以增強打印結(jié)構(gòu)的自我支撐能力。

機械性能
良好的機械性能使打印結(jié)構(gòu)得以維持，避免結(jié)構(gòu)變形、斷裂和體外培養(yǎng)的退化，這是至關重要的，并被用作評估生物墨水性能的重要指標。本研究測定了所有打印的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性。圖2a和2b顯示了不同水凝膠在37 ℃的DMEM溶液中的打印網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的代表性圖像。AG4結(jié)構(gòu)在第1天出現(xiàn)了裂縫，可能是由于高明膠濃度和低海藻酸鈉比例導致了鈣交聯(lián)的減弱和固化不良。AG1和AG2結(jié)構(gòu)在第3天出現(xiàn)了裂縫，但AG3在分解成幾個小塊之前保持了約14 d的形狀。缺乏化學交聯(lián)和用明膠修飾海藻酸鹽可能導致這些結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性差。GS結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出良好的結(jié)構(gòu)完整性，因為它們的形狀至少在14 d內(nèi)保持良好，這表明GelMA具有良好的支持性能。

圖2 3D細胞打印結(jié)構(gòu)的機械性能

在培養(yǎng)過程中，打印材料會膨脹或收縮。過度膨脹會導致結(jié)構(gòu)完整性的喪失或分層結(jié)構(gòu)的變形，而過度收縮則會堵塞孔隙，阻礙細胞遷移和營養(yǎng)物質(zhì)運輸。經(jīng)過28 d的培養(yǎng)，GS2構(gòu)建物保持完好，沒有顯示出膨脹或收縮的跡象，顯示出良好的機械性能，并為細胞生長提供穩(wěn)定的3D交聯(lián)網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)（圖2）。

生物相容性
生物相容性是評價生物墨水模擬天然細胞能力的一個重要指標，作為細胞外基質(zhì)，為細胞提供體內(nèi)觀察到的微環(huán)境，確保生物墨水內(nèi)的細胞在固化后能保持延伸、增殖、分化和連接，實現(xiàn)相互交流。將混合有PMSCs的AG3和GS水凝膠打印出來，在37 ℃下培養(yǎng)，觀察細胞生長。打印網(wǎng)格中的細胞密度隨著培養(yǎng)時間逐漸增加（如圖3中第1天和第3天所示），表明細胞生長。然而，各種GS結(jié)構(gòu)中的細胞生長速率是不同的。隨著絲素蛋白含量的增加，PMSCs進一步伸展，生長得更快，這一結(jié)果可能是由于絲素蛋白引起的水凝膠滲透性的改善，產(chǎn)生了更多的細胞黏附、生長和擴散的附著點。雖然AG3中的PMSCs一直在生長球狀體并保持細胞的活力，但這些球狀體不能伸展。由于細胞很容易被明膠包裹并容易結(jié)塊，它們可以存活很長時間，但它們在支架上的附著和擴散能力較差。

圖3 豬骨骼肌衛(wèi)星細胞在生長過程中的形態(tài)學變化

使用細胞活力和增殖試驗研究了GS水凝膠對細胞生存的影響。3D生物打印7 d后進行的活/死檢測（圖4）顯示，GS2的總細胞數(shù)和活細胞數(shù)最高（是GS0的2倍），其次是GS1和GS0；結(jié)果與圖3中的一致。在7 d的培養(yǎng)后，GS2的細胞分化也比GS1和GS0快（圖5）。GS2中的PMSCs增殖形成一個連續(xù)的片狀，形成肌管。這些結(jié)果表明，GS2表現(xiàn)出良好的生物相容性，有利于細胞生長、增殖和分化，因此可用于3D肌肉組織培養(yǎng)。

圖4 7 d齡培養(yǎng)物的活/死細胞染色結(jié)果

圖5 細胞骨架標記物肌動蛋白（綠色）和細胞核標記物4',6-二脒基-2-苯基吲哚（藍色）的細胞分化的代表性共聚焦3D圖像

3D生物打印支架的微孔結(jié)構(gòu)和孔隙率
3D生物打印支架的微孔結(jié)構(gòu)和孔隙率大大影響了細胞代謝。因此，有必要構(gòu)建高孔隙率的支架，并選擇具有良好滲透性和孔隙率的水凝膠，為細胞生長、增殖和分化提供足夠的空間。支架的微孔結(jié)構(gòu)和孔隙率與細胞類型和凝膠特性密切相關。

本研究中以同心圓模式研究了不同微孔尺寸對PMSCs生長的影響，在GS2中設置1.0、1.5、2.0和2.5 mm的線距，細胞密度為107 個/mL�？紤]到水凝膠的厚度，打印后的支架線距離比設定值少了約0.5 mm。

圖6 同心圓模式的3D打印

線距為1.0 mm（實際距離為0.5 mm）時，多層之間很容易發(fā)生堆疊，這適合于單層印刷。在其他線距下，隨著培養(yǎng)時間的增加，支架上的細胞不斷向外延伸；但只有在第5天和第10天之間觀察到7～20 μm的增加，這意味著細胞活動受到抑制，因為細胞在3D打印后被限制在一個納米級的水凝膠網(wǎng)絡中。先前的研究表明，孔隙率臨界增加會導致支架剛度下降。由于過大的線距會影響打印結(jié)構(gòu)的自支撐穩(wěn)定性，在本研究中，以線距1.5 mm和孔隙率1000 μm作為3D打印的標準。

與培養(yǎng)皿接觸的打印組織底層的細胞很容易黏附在壁上并迅速生長，填充了打印組織的小孢子。因此，對于長期的3D培養(yǎng)，必須優(yōu)化打印結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)皿之間的接觸面積，以避免代謝通道的堵塞。

多核肌管組成的肌肉組織的形成
多核肌管的形成和肌肉組織的成熟是培育肉制造的關鍵步驟。由于GS2顯示出最好的生物相容性和機械性能，它被進一步用來研究細胞增殖、成肌分化和肌管形成。GS2中的PMSCs表現(xiàn)出較高的細胞活力，并在14 d內(nèi)持續(xù)增殖，尤其是從第10天到第12天（圖7b）。細胞在支架上發(fā)展成致密狀態(tài)（圖7a），為隨后的細胞分化奠定了基礎。

圖7 GS2中豬骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖

由于組織厚度限制了3D培養(yǎng)中的細胞生長，本研究分別使用了厚度為2、3、4 mm的4、6、8層的3D打印網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，研究不同厚度對細胞生長和成肌分化的影響。培養(yǎng)7 d后，大多數(shù)PMSCs呈現(xiàn)出紡錘形結(jié)構(gòu)，盡管分化狀態(tài)是不均勻的，在4層打印結(jié)構(gòu)中形成更多的分化細胞和肌管。4層結(jié)構(gòu)的特點是均勻的細胞分布和初步融合的肌管，而其他兩種結(jié)構(gòu)的細胞分布是隨機的。結(jié)果表明，在培養(yǎng)的早期階段，層數(shù)少的組織可能表現(xiàn)出更高的營養(yǎng)輸送、細胞增殖和分化效率。

圖8 培養(yǎng)7 d時具有4、6、8層打印結(jié)構(gòu)的3D共聚焦熒光圖像

培養(yǎng)16 d后，對4、6、8層打印結(jié)構(gòu)的免疫熒光激光共聚焦成像（圖9）表明，打印組織中的PMSCs伸展良好，分化并逐漸融合在一起，形成粗大的多核肌管，在肌管和橢圓形肌管包繞的肌細胞之間形成了大量緊密貼合的細胞表面排列。此時，4層和6層組織的細胞分化程度是相似的，多核肌管沿著打印網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的路線展開，因此整個網(wǎng)格結(jié)構(gòu)形成了多核肌管組織的緊湊的肌肉纖維。細胞肌管的融合也發(fā)生在8層結(jié)構(gòu)中，但排列緊湊程度似乎比4層和6層結(jié)構(gòu)要弱。

圖9 培養(yǎng)16 d時4、6、8層網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的多核肌管的2D和3D圖像

本研究采用組織工程方法，利用3D生物打印技術(shù)為PMSCs構(gòu)建了一個3D培養(yǎng)系統(tǒng)，為細胞提供了一個完善的生長環(huán)境，促進了細胞高存活率、增殖、肌管形成和成肌分化，從而形成豬肌肉組織。 使用GS生物墨水和3D生物打印技術(shù)生產(chǎn)的產(chǎn)品模仿了天然肌肉的結(jié)構(gòu)和功能特性； 更重要的是，絲素蛋白很容易從養(yǎng)蠶業(yè)獲得，成本低，大大降低了生物墨水的成本。 因此，該技術(shù)在生產(chǎn)動物骨骼肌組織供培育肉使用方面具有很大的潛力。