Science Advances：3D生物打印雙因子釋放的梯度結(jié)構(gòu)支架促進(jìn)各向異性軟骨再生

來(lái)源：EngineeringForLife

軟骨損傷是一種常見的導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙的疾病，但由于軟骨細(xì)胞較少且無(wú)血管，其自愈能力有限�，F(xiàn)有的治療措施不能改善關(guān)節(jié)內(nèi)組織，往往由于感染或無(wú)菌性松動(dòng)而最終導(dǎo)致治療失敗。因此，尋找一種修復(fù)軟骨組織的方法成為了治療軟骨損傷的研究方向。近期，來(lái)自上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院戴尅戎院士團(tuán)隊(duì)在Science Advances上發(fā)表了題為"3D bioprinting dual-factor releasing and gradient-structured constructs ready to implant for anisotropic cartilage regeneration" 的文章，設(shè)計(jì)了一種具備良好生物相容性及力學(xué)性能的梯度結(jié)構(gòu)支架，用于軟骨修復(fù)。

首先，研究人員用PCL分別打印了梯度支架及非梯度支架的支撐結(jié)構(gòu)。其中，非梯度支架的纖維間距為150μm（提供生物力學(xué)刺激）或750μm（提供生物化學(xué)刺激），而梯度支架的纖維間距由表面150μm到深層750μm逐漸變化。同時(shí)，研究人員將骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP4）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3（TGFβ3）分別包裹到PLGA微球中，并將PLGA微球和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）包裹到水凝膠中，注射到PCL纖維間隙之間。為了更好模擬全層軟骨結(jié)構(gòu)，最深層為包裹BMP4的水凝膠，而上層為包裹TGFβ3的水凝膠（圖1）。

圖1 支架的設(shè)計(jì)及制備工藝

接著，研究人員觀察了支架的宏觀結(jié)構(gòu)及微觀結(jié)構(gòu)，并對(duì)支架的生物相容性及、細(xì)胞分布情況及細(xì)胞分化情況進(jìn)行表征，證實(shí)了每一層的水凝膠-PCL復(fù)合結(jié)構(gòu)具有良好的連通性和精細(xì)有序的結(jié)構(gòu)，支架具有良好的生物相容性，并且淺層的細(xì)胞為軟骨細(xì)胞表型，而深層的細(xì)胞為肥大軟骨細(xì)胞表型（圖2），證實(shí)了PCL支撐結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞的分布、營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)及增殖分化提供了適宜的環(huán)境。研究人員還證實(shí)細(xì)胞在水凝膠中形成了相互作用的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，并且可以沿PCL纖維分布、增殖（圖3），表明支架的水凝膠組分在打印過程中保持了細(xì)胞活力，并為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖、擴(kuò)散和濃縮提供了有利的微環(huán)境，以在體外分化為軟骨細(xì)胞。

圖2 PCL支架的性質(zhì)與功能

圖3 支架水凝膠組分的性質(zhì)及功能

隨后，研究人員通過TGFβ3和BMP4分別誘導(dǎo)BMSCs的分化，證實(shí)TGFβ3可以誘導(dǎo)BMSCs分化成為透明軟骨樣細(xì)胞，而BMP4可以誘導(dǎo)BMSCs表達(dá)肥大軟骨樣細(xì)胞相關(guān)蛋白。同時(shí)，研究人員將梯度支架與非梯度支架分別在體外培養(yǎng)12周，結(jié)果顯示非梯度支架約1/4-1/3形成軟骨樣組織，而梯度支架全層均形成軟骨樣組織，其楊氏模量與正常軟骨組織接近，且這些組織的蛋白表達(dá)均與正常軟骨組織類似，組織染色結(jié)果也呈現(xiàn)出類似結(jié)果（圖4）。這些結(jié)果證實(shí)梯度支架可以誘導(dǎo)BMSCs形成軟骨樣組織，且具備軟骨組織的力學(xué)性能。

圖4 雙因子釋放誘導(dǎo)梯度結(jié)構(gòu)支架中軟骨基質(zhì)的形成

研究人員進(jìn)一步將梯度支架植入兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損處，通過對(duì)組織大體外觀、組織染色及相關(guān)組織學(xué)評(píng)分進(jìn)行分析，證實(shí)了支架的軟骨修復(fù)作用（圖5），支架的淺層主要表現(xiàn)為軟骨樣細(xì)胞，而深層骨化標(biāo)記物表達(dá)顯著增加，證實(shí)了支架較大孔隙可以更好促進(jìn)微血管長(zhǎng)入及營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，誘導(dǎo)深層組織向成骨細(xì)胞方向分化（圖6）。

圖5 梯度結(jié)構(gòu)支架在兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損體內(nèi)模型中顯示出較好的各向異性軟骨修復(fù)效果

圖6 梯度結(jié)構(gòu)支架恢復(fù)了天然軟骨的各向異性，促進(jìn)微血管向深層生長(zhǎng)

綜上，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種具有梯度結(jié)構(gòu)、雙重分泌誘導(dǎo)因子的軟骨修復(fù)支架，具有良好的生物相容性及力學(xué)性能，在體外及體內(nèi)均具備形成軟骨樣組織的能力，為軟骨損傷的修復(fù)提供了新的思路。

參考文獻(xiàn)

YE SUN, YONGQING YOU, WENBO JIANG, BO WANG, QIANG WU, KERONG DAI . 3D bioprinting dual-factor releasing and gradient-structured constructs ready to implant for anisotropic cartilage regeneration. SCIENCE ADVANCES 09 SEP 2020 : EAAY1422. DOI: 10.1126/sciadv.aay1422