克萊姆森大學(xué)開(kāi)發(fā)直接3D打印微血管化生物墨水

來(lái)源：EngineeringForLife

三維（3D）生物打印為體外重建組織和器官提供了強(qiáng)大的平臺(tái)，但往往由于打印的組織缺乏血管化而導(dǎo)致無(wú)法實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期培養(yǎng)。過(guò)去十年，科學(xué)家們通過(guò)開(kāi)發(fā)犧牲生物材料和打印技術(shù)來(lái)間接構(gòu)建生物打印結(jié)構(gòu)內(nèi)的血管網(wǎng)絡(luò)。但是，間接方法制造的血管網(wǎng)絡(luò)直徑通常大于100μm，使得該方法很難重構(gòu)更為細(xì)微的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)打印后過(guò)程（包括去除犧牲材料和內(nèi)皮化中空網(wǎng)絡(luò)）也是復(fù)雜且耗時(shí)的。相比之下，直接生物打印可以提供一種有效的替代方法。天然生物高分子材料如纖維蛋白、膠原蛋白、明膠和脫細(xì)胞基質(zhì)等，因其具有良好的生物相容性，而被廣泛應(yīng)用于血管化生物打印。然而，蛋白質(zhì)衍生生物材料的復(fù)雜基質(zhì)屬性使其促血管生成特性的精細(xì)調(diào)控復(fù)雜化，并使其組成成分受到批次變化的影響。

近期，美國(guó)南卡羅來(lái)納州克萊姆森大學(xué)生物工程系的Ying Mei教授在Biomacromolecules發(fā)表題為Engineering a Chemically Defined Hydrogel Bioink for Direct Bioprinting of Microvasculature的文章。該團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種基于海藻酸鹽的水凝膠生物墨水，通過(guò)將RGD（一種用于細(xì)胞粘附的整合素結(jié)合肽）和一種帶有基質(zhì)金屬蛋白酶可裂解連接物（MMPQK）的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）模擬肽對(duì)藻酸鹽進(jìn)行修飾，可用于直接制造微血管組織結(jié)構(gòu)（圖1）。這種水凝膠既可以促進(jìn)血管形態(tài)發(fā)生，又可以實(shí)現(xiàn)遷移細(xì)胞的按需隔離。

圖1 應(yīng)用多肽功能化生物墨水直接打印血管化組織

為了將海藻酸鹽設(shè)計(jì)成一種具有生物相容性、生物可降解的生物墨水，該團(tuán)隊(duì)通過(guò)使用CuAAC“點(diǎn)擊”化學(xué)介導(dǎo)的生物偶聯(lián)技術(shù)，將具有促進(jìn)血管生成和血管發(fā)育的RGDSP和MMPQK肽偶聯(lián)到藻酸鹽水凝膠中。內(nèi)皮細(xì)胞中的整合素和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體之間交叉激活將協(xié)同誘導(dǎo)血管生成信號(hào)（圖2）。同時(shí)，該團(tuán)隊(duì)對(duì)這種多肽功能化海藻酸鹽水凝膠進(jìn)行了物化特性的研究。研究表明，多肽可以成功偶聯(lián)到海藻酸鹽上，且從三種多肽功能化海藻酸鹽（RGD+MMPQK,RGD ONLY,MMPQK ONLY）的儲(chǔ)存模量、損耗模量、水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)和電鏡掃描分析都得到相似的值（圖3）。這些結(jié)果表明三種水凝膠具有相似的機(jī)械和微觀結(jié)構(gòu)特性，為隨后的對(duì)比分析中研究多肽對(duì)血管形態(tài)的影響提供受控的環(huán)境。

圖2 血管生成水凝膠基質(zhì)設(shè)計(jì)思路

圖3 多肽功能化海藻酸鹽水凝膠的表征

為了研究RGD和MMPQK肽對(duì)微血管網(wǎng)絡(luò)形成的影響，該團(tuán)隊(duì)將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）和人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（HADSCs）包裹在功能化的藻酸鹽中培養(yǎng)，通過(guò)HUVEC面積、平均血管長(zhǎng)度、連接數(shù)/mm2三個(gè)指標(biāo)來(lái)量化血管形態(tài)發(fā)生。結(jié)果表明RGD+MMPQK水凝膠明顯優(yōu)于其他，即支持了先前的研究結(jié)果--整合素和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體的共激活導(dǎo)致協(xié)同信號(hào)增強(qiáng)血管形態(tài)發(fā)生（圖4a,b,d）。進(jìn)一步，該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)血管網(wǎng)絡(luò)的形成并不依賴(lài)培養(yǎng)基中的可溶性VEGF，而與hADSCs共培養(yǎng)是形成內(nèi)皮索狀網(wǎng)絡(luò)所必需的(圖4c)。當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，可在水凝膠內(nèi)觀察到廣泛的微血管形成(圖4e)，三維重建證明，HUVECs已經(jīng)聚集成直徑約為9μm管腔網(wǎng)絡(luò)(圖4f)。

圖4 多肽功能化海藻酸鹽水凝膠中的血管形態(tài)發(fā)生

為了將多肽功能化水凝膠用于3D生物打印，該團(tuán)隊(duì)通過(guò)采用部分離子交聯(lián)的方法，改善了低濃度海藻酸鹽的流變特性(即屈服應(yīng)力、剪切變稀和粘彈性)，以提高其可打印性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明2%(w/v) 海藻酸鹽溶液與15 mM的CaCl2部分交聯(lián)為最適溶液（圖5）。進(jìn)一步，該團(tuán)隊(duì)對(duì)部分交聯(lián)后的生物墨水進(jìn)行基準(zhǔn)評(píng)估。研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞均勻懸浮能力、細(xì)胞存活率、生物打印的重復(fù)性和準(zhǔn)確性方面，部分交聯(lián)的海藻酸鹽水凝膠都有顯著改善（圖6）。這些結(jié)果表明，部分交聯(lián)水凝膠前體方法為改善低粘度生物墨水可打印性提供了一種有效的策略。

圖5 通過(guò)部分離子交聯(lián)調(diào)節(jié)海藻酸鹽水凝膠前體的流變性能測(cè)試

圖6 部分交聯(lián)RGD+MMPQK海藻酸鹽生物墨水的可打印性測(cè)試

為了驗(yàn)證改良的生物墨水直接打印微血管組織的能力，該團(tuán)隊(duì)制作了VTU，一種由血管和組織特異性成分組成的異質(zhì)軟組織結(jié)構(gòu)，以模擬軟組織的基質(zhì)和實(shí)質(zhì)元素。該團(tuán)隊(duì)使用多噴嘴生物打印機(jī)，首先使用血管生成墨水打印點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)，然后使用第二個(gè)噴嘴打印格子空隙內(nèi)的組織的“芽”（圖7a）。對(duì)于組織成分，該團(tuán)隊(duì)使用了異于血管生成生物墨水的RGD功能化生物墨水。通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間共培養(yǎng)（7天及14天），血管成分的支柱和連接區(qū)形成了廣泛的微血管網(wǎng)絡(luò)，且RGD+MMQPK生物墨水顯著促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞的血管特異性表型和功能。此外，該實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，與均質(zhì)、混合結(jié)構(gòu)相比，異質(zhì)、分區(qū)的組織結(jié)構(gòu)中的血管形成增強(qiáng)（圖7）。

圖7 用部分交聯(lián)的RGD+MMPQK生物墨水制備VTU

綜上，這些結(jié)果不僅為我們的生物墨水支持血管形態(tài)發(fā)生的能力提供了證據(jù)，而且也證明了肽功能化的生物墨水用于直接制造異質(zhì)微血管組織的可行性研究者所提出的VTU模塊可應(yīng)用于體外傷口愈合和藥物毒性分析的血管化實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。