哈佛醫(yī)學(xué)院：四腳形氧化鋅基3D打印抗菌水凝膠，光控智能傷口支架

來源：水凝膠

整合了活性物質(zhì)以治療慢性傷口的先進傷口支架最近已引起廣泛關(guān)注。盡管傷口支架和先進的功能先前已被整合到一種醫(yī)療設(shè)備中，但無線觸發(fā)釋放活性物質(zhì)仍然是許多研究工作的重點。美國哈佛醫(yī)學(xué)院Su Ryon Shin、Leonard Siebert，韓國檀國大學(xué)Eunjung Lee等研究人員在《Advanced Functional Mateirals》上發(fā)表了題為LightControlled Growth Factors Release on Tetrapodal ZnOIncorporated 3DPrinted Hydrogels for Developing Smart Wound Scaffold的論文。科研人員為了結(jié)合多種功能，包括光觸發(fā)的激活，防腐，血管生成和保濕特性，開發(fā)了一種3D打印的水凝膠貼劑，該貼劑封裝了裝飾有光敏和抗菌四足狀氧化鋅（t-ZnO）微粒的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）。為了實現(xiàn)VEGF的智能釋放，通過化學(xué)處理對t-ZnO進行了改性，并通過紫外線/可見光對其進行了活化。此過程還將使表面粗糙并改善蛋白質(zhì)附著力。復(fù)合水凝膠的彈性模量和降解行為必須與傷口愈合過程匹配，可通過改變t-ZnO的濃度來進行調(diào)整。載有t-ZnO的復(fù)合水凝膠可以使用任何所需的微圖案進行印刷，從而有可能創(chuàng)建各種生長因子的模塊化洗脫液。載有VEGF的t-ZnO載水凝膠貼片顯示出低細胞毒性和改善的血管生成特性，同時在體外保持抗菌功能。體內(nèi)測試顯示出印刷傷口貼片的前景可觀，免疫原性降低，傷口愈合增強。

要點依據(jù)
1）為了實現(xiàn)VEGF的智能釋放，t-ZnO通過化學(xué)處理修飾并通過紫外線/可見光照射激活。這個過程也會使表面粗糙，提高蛋白質(zhì)的抵抗力。
2）復(fù)合水凝膠的彈性模量和降解行為必須與傷口愈合過程相匹配，可以通過改變t-ZnO濃度來調(diào)整。
3）負載-ZnO的復(fù)合水凝膠可以打印任何所需的微圖案，以潛在地創(chuàng)造出各種生長因子的取代。
4）VEGF修飾的t -ZnO水凝膠貼片在體外維持抗菌功能的同時顯示出低細胞毒性和改善血管生成特性。體內(nèi)試驗結(jié)果表明，打印的傷口貼片具有良好的效果，具有足夠的 免疫原性和促進傷口愈合。

示意圖1中簡要描述了智能傷口支架的工作原理及其制造。通過火焰?zhèn)鬏敽铣桑�作者獲得了整體尺寸為30–100 m的t-ZnO微粒。粒子獨特的3D四腳架形狀和高長寬比（直徑：≈100nm–10 m，長度：≈5–100 m）使它們難以穿透細胞，同時又使其與周圍介質(zhì)保持較大的接觸面積。除這些優(yōu)點外，t-ZnO還具有很強的抗菌作用。結(jié)合其半導(dǎo)體特性，它可以成為蛋白質(zhì)和藥物粘附與釋放的有益平臺。原始的t-ZnO在紫外（UV）范圍內(nèi)顯示帶隙。為了通過可見光刺激等自然條件提高VEGF的釋放速率，不需要特定的設(shè)備或工具，需要調(diào)節(jié)t-ZnO微粒使其具有光活性，并使它們能夠?qū)ψ贤饩�和相對生物安全的可見光起反應(yīng)范圍，同時保持其抗菌性能。

示意圖1智能傷口支架的制造過程示意圖和傷口愈合過程的工作原理：通過H2O2處理制備t-ZnO微粒，隨后進行VEGF吸附，并使用GelMA預(yù)聚物溶液制備復(fù)合油墨。在H2O2處理的ZnO微粒上觸發(fā)VEGF的光觸發(fā)釋放。VEGF包被的t-ZnO可以在傷口處嵌入開放的多孔印刷結(jié)構(gòu)，從而改善血管生成和抗菌活性。

用H2O2處理t-ZnO是改變t-ZnO的表面性質(zhì)（如蛋白質(zhì)附著力和光響應(yīng)性）而不降低t-ZnO的機械完整性的可行選擇。如圖1A所示，通過t-ZnO從白色到淡黃色的顏色變化，可以很容易地識別H2O2處理。通過顯微拉曼光譜研究了H2O2處理將ZnO表面轉(zhuǎn)化為過氧化鋅（ZnO2），如圖1B所示。未經(jīng)處理的t-ZnO和經(jīng)H2O2處理的t-ZnO均在100、440和1140 cm-1處顯示各自的特征峰。H2O2處理過的t-ZnO在850和1550 cm-1處還有與ZnO2相關(guān)的峰，表明從ZnO到ZnO2部分轉(zhuǎn)化。t-ZnO中某些ZnO峰的存在可能是由于ZnO到ZnO2的不完全轉(zhuǎn)化，從而有可能維持原始t-ZnO和H2O2處理過的t-ZnO的功能�；瘜W(xué)處理的持續(xù)時間決定了轉(zhuǎn)化程度，因此可以根據(jù)特定要求調(diào)整所需的ZnO2量。通過掃描電子顯微鏡（SEM）評估過氧化氫處理前后的t-ZnO形態(tài)，分別如圖1C-i和D-i所示。

圖1經(jīng)過化學(xué)處理的t-ZnO的調(diào)諧光敏特性。

為了開發(fā)可保護傷口免受外界環(huán)境條件和感染侵害的at-ZnO嵌入式傷口支架，GelMA水凝膠因其吸引人的吸液性能，類似于膠原的生物學(xué)特性，通過各種微細加工技術(shù)的結(jié)構(gòu)保真度而被用于促進傷口支架的生長，為了防止t-ZnO顆粒在交聯(lián)過程中重新聚結(jié)或沉淀，在將t-ZnO負載的GelMA預(yù)聚物溶液倒入模具中的同時，溫度迅速降低，從而降低了溫度。GelMA預(yù)聚物溶液的粘度顯著增加。交聯(lián)后，作者觀察到GelMA水凝膠中的大多數(shù)t-ZnO顆粒沒有以相等的間隔分布，但仍顯示出GelMA水凝膠中的t-ZnO顆粒均勻分布，如圖2A所示。

圖2負載t-ZnO的水凝膠的機械性能。

通過增加t-ZnO的濃度，復(fù)合水凝膠仍保持了原始GelMA水凝膠的多孔性質(zhì)，而對形態(tài)變化沒有任何顯著影響（圖2B）。此外，t-ZnO微粒的四足體臂伸出水凝膠的表面，已被證明可提供出色的抗菌性能，同時支持多孔支架中的細胞生長。在圖2C-i中，作者在復(fù)合水凝膠的表面上觀察到大量的四足臂（用紅色箭頭表示）。同樣，經(jīng)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)擠出的四足臂，如圖2C-ii中的紅色箭頭所示，都被GelMA水凝膠包被。這些擠壓的四足臂明顯增加了復(fù)合水凝膠的表面粗糙度，這是使用原子力顯微鏡（AFM）通過地形圖測得的（圖2D）。

高濃度的GelMA水凝膠（> 5％w/v）具有致密的結(jié)構(gòu)，高濃度的GelMA水凝膠可能在體內(nèi)和體外引起緩慢的降解行為，并減緩生物分子或藥物的釋放。為了解決這些問題，與本體水凝膠相比，具有開放式多孔微結(jié)構(gòu)的微加工水凝膠具有較大的表面積，可以幫助調(diào)節(jié)降解速率并實現(xiàn)所需的釋放性能。它們還可以幫助氧氣通過開放的多孔結(jié)構(gòu)將氧氣流到傷口部位，從而改善傷口的愈合效果。為此，開發(fā)了3D打印技術(shù)以使用復(fù)合水凝膠墨水（如t-ZnO嵌入）制造可再現(xiàn)的開放的多孔3D結(jié)構(gòu)。 GelMA水凝膠。在圖3A中示意性地示出了印刷過程。為了防止在四腳架中發(fā)生破裂，由于四腳架的形狀復(fù)雜且縱橫比高（某些顆粒的直徑最大為0.1 mm），所以使用了較大的噴嘴尺寸（內(nèi)徑：0.4 mm）。這些措施使打印成功，如圖3B，C所示。

圖3 負載t-ZnO的GelMA水凝膠結(jié)構(gòu)的3D打印。

優(yōu)化打印參數(shù)后，對涂有VEGF的t-ZnO的GelMA水凝膠進行了表征，以研究復(fù)合水凝膠表面細胞功能，附著和增殖的可行性（圖4）。 傷口愈合取決于許多因素，例如不同細胞譜系與特定功能的相互作用。人類臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）是涉及血管生成和傷口愈合的關(guān)鍵作用的代表性細胞類型，被培養(yǎng)并接種在頂部水凝膠。C2C12成肌細胞，以前曾用來測量t-ZnO顆粒的細胞毒性，也被用來評估構(gòu)建體內(nèi)t-ZnO微粒的細胞相容性。

圖4 VEGF包覆的t-ZnO GelMA水凝膠的體外表征。

盡管通常在正常皮膚上發(fā)現(xiàn)細菌菌落，但表皮完整性的喪失可能削弱與控制細菌生長有關(guān)的機制，并可能促進傷口感染。細菌入侵導(dǎo)致代謝壓力增加和促炎狀態(tài)。這導(dǎo)致組織損傷和慢性傷口形成。因此，抗菌質(zhì)量的實施對于慢性傷口的正確愈合至關(guān)重要。t-ZnO的抗菌活性原理如圖5A所示。t-ZnO形成的ROS物種可以提供良好的治療窗口，在該窗口中，抗菌活性，血管生成和傷口愈合都很高。此外，細菌直接接觸可能會直接破壞細菌。如圖2B，C所示，t-ZnO的穿透臂數(shù)通過增加微粒濃度而增加，這可能導(dǎo)致不同程度的抗菌活性。

圖5負載t-ZnO的GelMA水凝膠與t-ZnO粉末相比具有抗菌功能。

進行了皮下體內(nèi)研究，從生物降解性和與鄰近組織的生物相容性方面評估了生產(chǎn)的水凝膠的生物穩(wěn)定性（圖6A）。皮下移植后，進行H＆E染色以鑒定水凝膠與其周圍組織之間的反應(yīng)。由于其良好的生物相容性，未在所有移植的水凝膠附近觀察到包封的纖維組織，這在組織重塑過程中可能是一個問題。尤其是，觀察到含t-ZnO的材料與鄰近組織有良好的連接（圖6B）。大部分水凝膠在移植后4周仍保留。1％VEGF包覆的H2O2/t-ZnO表現(xiàn)出最大的生物降解趨勢（圖6C）。

圖6使用體內(nèi)皮下試驗評估VEGF包覆的t-ZnO負載的GelMA水凝膠的生物相容性和血管生成。

參考文獻：doi.org/10.1002/adfm.202007555