哈佛醫(yī)學(xué)院：四腳形氧化鋅基3D打印抗菌水凝膠，光控智能傷口支架

來(lái)源：水凝膠

整合了活性物質(zhì)以治療慢性傷口的先進(jìn)傷口支架最近已引起廣泛關(guān)注。盡管傷口支架和先進(jìn)的功能先前已被整合到一種醫(yī)療設(shè)備中，但無(wú)線觸發(fā)釋放活性物質(zhì)仍然是許多研究工作的重點(diǎn)。美國(guó)哈佛醫(yī)學(xué)院Su Ryon Shin、Leonard Siebert，韓國(guó)檀國(guó)大學(xué)Eunjung Lee等研究人員在《Advanced Functional Mateirals》上發(fā)表了題為L(zhǎng)ightControlled Growth Factors Release on Tetrapodal ZnOIncorporated 3DPrinted Hydrogels for Developing Smart Wound Scaffold的論文�？蒲腥藛T為了結(jié)合多種功能，包括光觸發(fā)的激活，防腐，血管生成和保濕特性，開(kāi)發(fā)了一種3D打印的水凝膠貼劑，該貼劑封裝了裝飾有光敏和抗菌四足狀氧化鋅（t-ZnO）微粒的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）。為了實(shí)現(xiàn)VEGF的智能釋放，通過(guò)化學(xué)處理對(duì)t-ZnO進(jìn)行了改性，并通過(guò)紫外線/可見(jiàn)光對(duì)其進(jìn)行了活化。此過(guò)程還將使表面粗糙并改善蛋白質(zhì)附著力。復(fù)合水凝膠的彈性模量和降解行為必須與傷口愈合過(guò)程匹配，可通過(guò)改變t-ZnO的濃度來(lái)進(jìn)行調(diào)整。載有t-ZnO的復(fù)合水凝膠可以使用任何所需的微圖案進(jìn)行印刷，從而有可能創(chuàng)建各種生長(zhǎng)因子的模塊化洗脫液。載有VEGF的t-ZnO載水凝膠貼片顯示出低細(xì)胞毒性和改善的血管生成特性，同時(shí)在體外保持抗菌功能。體內(nèi)測(cè)試顯示出印刷傷口貼片的前景可觀，免疫原性降低，傷口愈合增強(qiáng)。

要點(diǎn)依據(jù)
1）為了實(shí)現(xiàn)VEGF的智能釋放，t-ZnO通過(guò)化學(xué)處理修飾并通過(guò)紫外線/可見(jiàn)光照射激活。這個(gè)過(guò)程也會(huì)使表面粗糙，提高蛋白質(zhì)的抵抗力。
2）復(fù)合水凝膠的彈性模量和降解行為必須與傷口愈合過(guò)程相匹配，可以通過(guò)改變t-ZnO濃度來(lái)調(diào)整。
3）負(fù)載-ZnO的復(fù)合水凝膠可以打印任何所需的微圖案，以潛在地創(chuàng)造出各種生長(zhǎng)因子的取代。
4）VEGF修飾的t -ZnO水凝膠貼片在體外維持抗菌功能的同時(shí)顯示出低細(xì)胞毒性和改善血管生成特性。體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明，打印的傷口貼片具有良好的效果，具有足夠的 免疫原性和促進(jìn)傷口愈合。

示意圖1中簡(jiǎn)要描述了智能傷口支架的工作原理及其制造。通過(guò)火焰?zhèn)鬏敽铣�，作者獲得了整體尺寸為30–100 m的t-ZnO微粒。粒子獨(dú)特的3D四腳架形狀和高長(zhǎng)寬比（直徑：≈100nm–10 m，長(zhǎng)度：≈5–100 m）使它們難以穿透細(xì)胞，同時(shí)又使其與周?chē)�介質(zhì)保持較大的接觸面積。除這些優(yōu)點(diǎn)外，t-ZnO還具有很強(qiáng)的抗菌作用。結(jié)合其半導(dǎo)體特性，它可以成為蛋白質(zhì)和藥物粘附與釋放的有益平臺(tái)。原始的t-ZnO在紫外（UV）范圍內(nèi)顯示帶隙。為了通過(guò)可見(jiàn)光刺激等自然條件提高VEGF的釋放速率，不需要特定的設(shè)備或工具，需要調(diào)節(jié)t-ZnO微粒使其具有光活性，并使它們能夠?qū)ψ贤饩�和相對(duì)生物安全的可見(jiàn)光起反應(yīng)范圍，同時(shí)保持其抗菌性能。

示意圖1智能傷口支架的制造過(guò)程示意圖和傷口愈合過(guò)程的工作原理：通過(guò)H2O2處理制備t-ZnO微粒，隨后進(jìn)行VEGF吸附，并使用GelMA預(yù)聚物溶液制備復(fù)合油墨。在H2O2處理的ZnO微粒上觸發(fā)VEGF的光觸發(fā)釋放。VEGF包被的t-ZnO可以在傷口處嵌入開(kāi)放的多孔印刷結(jié)構(gòu)，從而改善血管生成和抗菌活性。

用H2O2處理t-ZnO是改變t-ZnO的表面性質(zhì)（如蛋白質(zhì)附著力和光響應(yīng)性）而不降低t-ZnO的機(jī)械完整性的可行選擇。如圖1A所示，通過(guò)t-ZnO從白色到淡黃色的顏色變化，可以很容易地識(shí)別H2O2處理。通過(guò)顯微拉曼光譜研究了H2O2處理將ZnO表面轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化鋅（ZnO2），如圖1B所示。未經(jīng)處理的t-ZnO和經(jīng)H2O2處理的t-ZnO均在100、440和1140 cm-1處顯示各自的特征峰。H2O2處理過(guò)的t-ZnO在850和1550 cm-1處還有與ZnO2相關(guān)的峰，表明從ZnO到ZnO2部分轉(zhuǎn)化。t-ZnO中某些ZnO峰的存在可能是由于ZnO到ZnO2的不完全轉(zhuǎn)化，從而有可能維持原始t-ZnO和H2O2處理過(guò)的t-ZnO的功能�；瘜W(xué)處理的持續(xù)時(shí)間決定了轉(zhuǎn)化程度，因此可以根據(jù)特定要求調(diào)整所需的ZnO2量。通過(guò)掃描電子顯微鏡（SEM）評(píng)估過(guò)氧化氫處理前后的t-ZnO形態(tài)，分別如圖1C-i和D-i所示。

圖1經(jīng)過(guò)化學(xué)處理的t-ZnO的調(diào)諧光敏特性。

為了開(kāi)發(fā)可保護(hù)傷口免受外界環(huán)境條件和感染侵害的at-ZnO嵌入式傷口支架，GelMA水凝膠因其吸引人的吸液性能，類(lèi)似于膠原的生物學(xué)特性，通過(guò)各種微細(xì)加工技術(shù)的結(jié)構(gòu)保真度而被用于促進(jìn)傷口支架的生長(zhǎng)，為了防止t-ZnO顆粒在交聯(lián)過(guò)程中重新聚結(jié)或沉淀，在將t-ZnO負(fù)載的GelMA預(yù)聚物溶液倒入模具中的同時(shí)，溫度迅速降低，從而降低了溫度。GelMA預(yù)聚物溶液的粘度顯著增加。交聯(lián)后，作者觀察到GelMA水凝膠中的大多數(shù)t-ZnO顆粒沒(méi)有以相等的間隔分布，但仍顯示出GelMA水凝膠中的t-ZnO顆粒均勻分布，如圖2A所示。

圖2負(fù)載t-ZnO的水凝膠的機(jī)械性能。

通過(guò)增加t-ZnO的濃度，復(fù)合水凝膠仍保持了原始GelMA水凝膠的多孔性質(zhì)，而對(duì)形態(tài)變化沒(méi)有任何顯著影響（圖2B）。此外，t-ZnO微粒的四足體臂伸出水凝膠的表面，已被證明可提供出色的抗菌性能，同時(shí)支持多孔支架中的細(xì)胞生長(zhǎng)。在圖2C-i中，作者在復(fù)合水凝膠的表面上觀察到大量的四足臂（用紅色箭頭表示）。同樣，經(jīng)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)擠出的四足臂，如圖2C-ii中的紅色箭頭所示，都被GelMA水凝膠包被。這些擠壓的四足臂明顯增加了復(fù)合水凝膠的表面粗糙度，這是使用原子力顯微鏡（AFM）通過(guò)地形圖測(cè)得的（圖2D）。

高濃度的GelMA水凝膠（> 5％w/v）具有致密的結(jié)構(gòu)，高濃度的GelMA水凝膠可能在體內(nèi)和體外引起緩慢的降解行為，并減緩生物分子或藥物的釋放。為了解決這些問(wèn)題，與本體水凝膠相比，具有開(kāi)放式多孔微結(jié)構(gòu)的微加工水凝膠具有較大的表面積，可以幫助調(diào)節(jié)降解速率并實(shí)現(xiàn)所需的釋放性能。它們還可以幫助氧氣通過(guò)開(kāi)放的多孔結(jié)構(gòu)將氧氣流到傷口部位，從而改善傷口的愈合效果。為此，開(kāi)發(fā)了3D打印技術(shù)以使用復(fù)合水凝膠墨水（如t-ZnO嵌入）制造可再現(xiàn)的開(kāi)放的多孔3D結(jié)構(gòu)。 GelMA水凝膠。在圖3A中示意性地示出了印刷過(guò)程。為了防止在四腳架中發(fā)生破裂，由于四腳架的形狀復(fù)雜且縱橫比高（某些顆粒的直徑最大為0.1 mm），所以使用了較大的噴嘴尺寸（內(nèi)徑：0.4 mm）。這些措施使打印成功，如圖3B，C所示。

圖3 負(fù)載t-ZnO的GelMA水凝膠結(jié)構(gòu)的3D打印。

優(yōu)化打印參數(shù)后，對(duì)涂有VEGF的t-ZnO的GelMA水凝膠進(jìn)行了表征，以研究復(fù)合水凝膠表面細(xì)胞功能，附著和增殖的可行性（圖4）。 傷口愈合取決于許多因素，例如不同細(xì)胞譜系與特定功能的相互作用。人類(lèi)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）是涉及血管生成和傷口愈合的關(guān)鍵作用的代表性細(xì)胞類(lèi)型，被培養(yǎng)并接種在頂部水凝膠。C2C12成肌細(xì)胞，以前曾用來(lái)測(cè)量t-ZnO顆粒的細(xì)胞毒性，也被用來(lái)評(píng)估構(gòu)建體內(nèi)t-ZnO微粒的細(xì)胞相容性。

圖4 VEGF包覆的t-ZnO GelMA水凝膠的體外表征。

盡管通常在正常皮膚上發(fā)現(xiàn)細(xì)菌菌落，但表皮完整性的喪失可能削弱與控制細(xì)菌生長(zhǎng)有關(guān)的機(jī)制，并可能促進(jìn)傷口感染。細(xì)菌入侵導(dǎo)致代謝壓力增加和促炎狀態(tài)。這導(dǎo)致組織損傷和慢性傷口形成。因此，抗菌質(zhì)量的實(shí)施對(duì)于慢性傷口的正確愈合至關(guān)重要。t-ZnO的抗菌活性原理如圖5A所示。t-ZnO形成的ROS物種可以提供良好的治療窗口，在該窗口中，抗菌活性，血管生成和傷口愈合都很高。此外，細(xì)菌直接接觸可能會(huì)直接破壞細(xì)菌。如圖2B，C所示，t-ZnO的穿透臂數(shù)通過(guò)增加微粒濃度而增加，這可能導(dǎo)致不同程度的抗菌活性。

圖5負(fù)載t-ZnO的GelMA水凝膠與t-ZnO粉末相比具有抗菌功能。

進(jìn)行了皮下體內(nèi)研究，從生物降解性和與鄰近組織的生物相容性方面評(píng)估了生產(chǎn)的水凝膠的生物穩(wěn)定性（圖6A）。皮下移植后，進(jìn)行H＆E染色以鑒定水凝膠與其周?chē)�組織之間的反應(yīng)。由于其良好的生物相容性，未在所有移植的水凝膠附近觀察到包封的纖維組織，這在組織重塑過(guò)程中可能是一個(gè)問(wèn)題。尤其是，觀察到含t-ZnO的材料與鄰近組織有良好的連接（圖6B）。大部分水凝膠在移植后4周仍保留。1％VEGF包覆的H2O2/t-ZnO表現(xiàn)出最大的生物降解趨勢(shì)（圖6C）。

圖6使用體內(nèi)皮下試驗(yàn)評(píng)估VEGF包覆的t-ZnO負(fù)載的GelMA水凝膠的生物相容性和血管生成。

參考文獻(xiàn)：doi.org/10.1002/adfm.202007555