伊利諾伊大學(xué)：無(wú)顆粒3D打印導(dǎo)電水凝膠可神經(jīng)元生長(zhǎng)和電生理記錄

來(lái)源：高分子材料科學(xué)

最近，伊利諾伊大學(xué)香檳分校Chen Wang博士/Ralph G. Nuzzo教授團(tuán)隊(duì)在《Advanced Functional Materials》上發(fā)表了題為3D ParticleFree Printing of Biocompatible Conductive Hydrogel Platforms for Neuron Growth and Electrophysiological Recording論文。他們論述了導(dǎo)電3D周期微支架是使用無(wú)顆粒直接墨水書(shū)寫(xiě)方法制造的，用作神經(jīng)元生長(zhǎng)和電生理記錄平臺(tái)。聚（甲基丙烯酸2-羥乙酯）/吡咯油墨，然后進(jìn)行吡咯的化學(xué)原位聚合，可以通過(guò)小至1 m的噴嘴進(jìn)行水凝膠打印。這些導(dǎo)電水凝膠可對(duì)復(fù)雜的2D和3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行圖案化，并與測(cè)試細(xì)胞培養(yǎng)物具有良好的生物相容性（7天后的活力約為94.5％）。水凝膠陣列促進(jìn)廣泛培養(yǎng)的加州Ap腳踏板神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的神經(jīng)突生長(zhǎng)。該平臺(tái)允許細(xì)胞外電生理記錄穩(wěn)態(tài)和刺激的電神經(jīng)元活動(dòng)�？偠�言之，這種3D導(dǎo)電油墨打印工藝能夠制備生物相容性和微米級(jí)的結(jié)構(gòu)，以創(chuàng)建定制的體外電生理記錄平臺(tái)。

導(dǎo)電水凝膠的打印和表征
設(shè)計(jì)用于直接墨水書(shū)寫(xiě)的新墨水，使其能夠制造具有細(xì)胞大小尺度特征尺寸的電生理凝膠平臺(tái)。這種可打印材料由乙醇水溶液中各種分子量的pHEMA鏈與吡咯共聚單體的物理纏結(jié)聚合物網(wǎng)絡(luò)組成。圖1示意性地說(shuō)明了這種成分和制造順序，以獲得導(dǎo)電凝膠支架。對(duì)pHEMA均聚物的含量進(jìn)行了優(yōu)化，以滿(mǎn)足直接墨水書(shū)寫(xiě)的流變要求和適用于細(xì)胞培養(yǎng)研究的功能性凝膠復(fù)合材料的要求。聚合物網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)在打印過(guò)程中將吡咯單體限制在水凝膠基質(zhì)中，隨后用氯化鐵進(jìn)行處理會(huì)引起原位聚合并摻雜生成的互穿聚吡咯。在處理后數(shù)分鐘內(nèi)，打印的水凝膠從無(wú)色透明變?yōu)樯詈谏�，可�?jiàn)聚合和摻雜。充分漂洗打印的圖案，然后每4小時(shí)浸入去離子水中，每4小時(shí)進(jìn)行4次水交換，以除去未反應(yīng)的單體。由于這種微細(xì)加工工藝使油墨打印與原位導(dǎo)電顆粒形成分離，因此可以獲得微米級(jí)的特征寬度。導(dǎo)電細(xì)絲的輕松，無(wú)堵塞擠壓可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的3D結(jié)構(gòu)形成（如圖2所示）。

圖1 不含導(dǎo)電顆粒的水凝膠的形成示意圖。頂行表示打印結(jié)構(gòu)的宏觀視圖，而底行表示水凝膠形成三個(gè)階段的精細(xì)結(jié)構(gòu)。下排圖片中的綠線表示聚HEMA鏈，黃色三角形表示吡咯單體，棕點(diǎn)表示吡咯低聚物，黑點(diǎn)表示聚吡咯顆粒。

圖2 水凝膠油墨的特性包括其流變行為和形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的能力。a）墨水存儲(chǔ)模量（G'）和損耗模量（G''）在1Hz頻率下以振蕩模式在1Hz下測(cè)量，顯示出墨水具有類(lèi)似液體的響應(yīng)。b）測(cè)得的油墨粘度是剪切速率的函數(shù)，并顯示了3D打印所需的剪切稀化特性，黑線顯示了剪切稀化指數(shù)。c）使用1 m尖端打印的圖案的透射光光學(xué)顯微鏡圖像證明了使用小噴嘴進(jìn)行可行的打印。d）打印的3D金字塔結(jié)構(gòu)圖像顯示墨水具有出色的3D可構(gòu)建性，單絲用箭頭標(biāo)記。

流變性質(zhì)是影響3D微結(jié)構(gòu)打印的重要因素。此處，油墨的流變功能和打印結(jié)構(gòu)的示例如圖2所示。在流變學(xué)表征期間，水凝膠油墨處于水合狀態(tài)，使用水和乙醇的溶劑阱來(lái)防止測(cè)量過(guò)程中的蒸發(fā)。優(yōu)化了pHEMA-吡咯水凝膠油墨的彈性模量和粘滯模量，使油墨絲能夠跨越底層的縫隙，同時(shí)保持其形狀。

由打印的絲狀（脫水）結(jié)構(gòu)制成的SEM分析（圖3a，b）揭示了固化步驟形成的PPy的一般形態(tài)特征；這些顯微照片揭示了一個(gè)緊密滲透的納米顆粒網(wǎng)絡(luò)（圖3c，d）。pHEMA絲狀網(wǎng)絡(luò)形成了更加分散的基質(zhì)，該基質(zhì)在物理上限制了復(fù)合材料水合狀態(tài)下的這種密集的納米粒子種群。從結(jié)構(gòu)的高放大倍數(shù)俯視圖判斷（圖3c），與純pHEMA薄膜和打印結(jié)構(gòu)形成的邊界相比，這些納米粒子使復(fù)合材料的表面明顯更粗糙。細(xì)絲結(jié)構(gòu)的高分辨率橫截面SEM圖像表明，在細(xì)絲的整個(gè)內(nèi)部域中都存在直徑≈100nm的PPy納米顆粒（圖3d）。

圖3 印出的“ I”圖案的宏觀和SEM圖像包括：a）印出的圖案具有1 mm比例尺的照片，b）從（a ）用400 m的比例尺，c）用100 nm的比例尺放大（b）中描繪的單條打印線的突出顯示區(qū)域的圖像，以及d）導(dǎo)電水凝膠圖案的橫截面的SEM圖像，其中 500 nm比例尺。

將使用電化學(xué)工作站測(cè)量的復(fù)合水凝膠的電導(dǎo)率與四點(diǎn)探針測(cè)量的結(jié)果進(jìn)行比較（圖4a）。通過(guò)在PBS緩沖液中對(duì)Ag/AgCl進(jìn)行多次CV掃描來(lái)探索水凝膠的電化學(xué)穩(wěn)定性，如圖4b所示。復(fù)合水凝膠的電容行為和法拉第電流有助于提高電荷轉(zhuǎn)移效率，并最終在設(shè)備/電池界面記錄信號(hào)質(zhì)量。作者還從宏觀角度評(píng)估了材料作為電導(dǎo)體的性能（圖4c，d）。在此，將復(fù)合水凝膠絲網(wǎng)打印并插入具有4.5 V LED光源和電源的電路中。該演示表明，當(dāng)由5V DC施加的偏壓供電時(shí)，打印的圖案可以支持LED的發(fā)射。

圖4 導(dǎo)電水凝膠油墨的電和電化學(xué)特性。a）導(dǎo)電水凝膠薄膜的阻抗幅度隨頻率變化的I-V曲線和波特圖顯示出固有電導(dǎo)率為13.59 S cm-1，歸一化阻抗為8.4Ωcm2。b）PBS緩沖液中的導(dǎo)電水凝膠薄膜相對(duì)于Ag/AgCl的CV掃描結(jié)果（20個(gè)循環(huán)，掃描速度20 mV s-1）顯示聚吡咯的還原和氧化。c，d）當(dāng)連接到以打印的水凝膠網(wǎng)作為導(dǎo)體并施加5V電壓的電路中時(shí)，LED點(diǎn)亮。響應(yīng)于所提供的功率，LED的照明和變暗證明了水凝膠網(wǎng)的導(dǎo)電性。

評(píng)價(jià)復(fù)合水凝膠的生物相容性
pHEMA和PPy都沒(méi)有細(xì)胞毒性的報(bào)道，已被廣泛用作各種生物分析應(yīng)用中的活性和輔助材料。這里展示的是新復(fù)合材料的直接生物相容性測(cè)試結(jié)果，表明該材料可用作基底以支持培養(yǎng)中細(xì)胞正常生長(zhǎng)的模式，甚至促進(jìn)有用形式的細(xì)胞從玻璃基底遷移并附著在打印導(dǎo)電絲上。在這些實(shí)驗(yàn)中（圖5），將設(shè)備滅菌后，將MC-3T3-E1前成骨細(xì)胞接種到帶有打印U型復(fù)合細(xì)絲的導(dǎo)電水凝膠薄膜或載玻片上（圖5a-d），如實(shí)驗(yàn)中所述部分。在7天的培養(yǎng)期內(nèi)，使用活/死分析評(píng)估了薄膜支持的培養(yǎng)物上的細(xì)胞活力，并在第1、3和7天對(duì)死（紅色）和活（綠色）細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)（圖5b，e） 。

圖5 導(dǎo)電水凝膠的生物相容性評(píng)估顯示出高存活率并促進(jìn)細(xì)胞遷移。a）在水凝膠薄膜上進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方案，其中b）在導(dǎo)電水凝膠薄膜上培養(yǎng)7天并用活/死分析法染色的成骨細(xì)胞的熒光圖像�；罴�(xì)胞呈現(xiàn)綠色，呈死紅色。c）培養(yǎng)的細(xì)胞遷移到打印出的U形導(dǎo)電圖案上的方案，其中d）培養(yǎng)7天后細(xì)胞遷移到打印的細(xì)絲上的熒光圖像，箭頭表示遷移方向。e）在第1、3和7天，水凝膠薄膜上的成骨細(xì)胞的存活率。f）導(dǎo)電水凝膠的表面電荷測(cè)量，以及在無(wú)聚吡咯的pHEMA水凝膠（黑色）和導(dǎo)電水凝膠（紅色）的PBS緩沖液中的參比。

用于單個(gè)培養(yǎng)的神經(jīng)元電生理記錄的基于導(dǎo)電墨水的平臺(tái)
墨水的電導(dǎo)率和生物相容性允許制造電生理記錄平臺(tái)，用于研究培養(yǎng)的神經(jīng)元的電活動(dòng)（圖6a）。圖6b描述了在記錄之前單元與打印陣列的兩種類(lèi)型的交互。這些代表性的數(shù)據(jù)顯示了優(yōu)選與陣列的復(fù)合水凝膠材料進(jìn)行最大程度接觸的細(xì)胞相互作用的行為：較小的細(xì)胞傾向于以陣列細(xì)絲的頂部為中心，而較大的細(xì)胞更常見(jiàn)地跨越兩個(gè)相鄰的陣列細(xì)絲。像成骨細(xì)胞一樣，培養(yǎng)基中存在的帶正電的表面也不會(huì)抑制細(xì)胞附著，因此不需要額外的表面處理。圖6c顯示了從記錄和刺激組及其相應(yīng)的控制設(shè)備獲取的電生理記錄。與之形成鮮明對(duì)比的是，來(lái)自記錄和刺激組的信號(hào)顯示了動(dòng)作電位，具有來(lái)自記錄和刺激實(shí)驗(yàn)的代表性單個(gè)尖峰（圖6d）。神經(jīng)元與陣列的長(zhǎng)期相互作用（圖6e）突出顯示了導(dǎo)電水凝膠的生物相容性，在培養(yǎng)5天后，神經(jīng)元沿陣列的細(xì)絲大量向外生長(zhǎng)。

總結(jié)
作者已經(jīng)開(kāi)發(fā)并成功測(cè)試了具有出色生物相容性和高空間分辨率的3D可打印導(dǎo)電水凝膠油墨。微周期導(dǎo)電陣列已被制造并用作神經(jīng)元細(xì)胞外信號(hào)記錄平臺(tái)。證明了這種陣列有助于在穩(wěn)態(tài)和刺激狀態(tài)下檢測(cè)神經(jīng)元活動(dòng)的能力。這種可編程的導(dǎo)電水凝膠為制造高空間分辨率的平臺(tái)提供了新的機(jī)會(huì)，該平臺(tái)可以幫助研究包括神經(jīng)元在內(nèi)的不同電活性細(xì)胞的體外和體內(nèi)活性。