AM 細胞外基質(zhì)增強型生物墨水用于人體組織的3D打印

來源： EngineeringForLife

3D生物打印技術(shù)主要是用生物材料和活體細胞，模擬體內(nèi)器官結(jié)構(gòu)，通過3D打印的形式將器官打印出來，該技術(shù)有望成為未來器官移植的重要手段。但迄今為止，3D生物打印的研究大多局限于構(gòu)造結(jié)構(gòu)簡單的組織，如皮膚和心肌補片。目前，研究人員已經(jīng)探索了幾種提高生物墨水生物活性的技術(shù)，如結(jié)合特定配體及對材料表面進行功能化修飾以增強細胞粘附或血管生成等。然而，這些手段通常專注于增強組織發(fā)育某一階段的生物活性(例如，細胞粘附或促血管形成等)。

脫細胞化細胞外基質(zhì)(dECM)來源于天然組織，是一種潛在的具有組織特異性成分的生物墨水。然而細胞外基質(zhì)較差的凝膠動力學(xué)特性限制了其3D生物打印的精度，為了克服單一細胞外基質(zhì)生物墨水的局限性，瑞典隆德大學(xué)瓦倫堡分子醫(yī)學(xué)中心Nathaniel S.Hwang研究團隊在Advanced Materials上發(fā)表題為“Extracellular-Matrix-Reinforced Bioinks for 3D Bioprinting Human Tissue”的文章。研究者制備了一種組織特異性復(fù)合生物墨水，它由天然聚合物海藻酸鹽組成，并用脫細胞化的細胞外基質(zhì)（dECM）增強生物活性，該復(fù)合生物墨水可用于構(gòu)建具有一定尺度的無需外部支撐結(jié)構(gòu)的可灌注管狀和分支結(jié)構(gòu)。此外，該復(fù)合生物墨水中的ECM增強了3D生物打印過程中原代人祖細胞的存活，支持組織特異性細胞分化，并在體內(nèi)刺激植入物的全層血管化，同時最大限度地減少異體反應(yīng)。

由于ECM組分的自發(fā)自組裝，從胃蛋白酶消化脫細胞組織得到的ECM溶液在37°C時可形成凝膠，因此需要一個支撐結(jié)構(gòu)來使用3D打印形成更復(fù)雜的幾何形狀。海藻酸鈉對哺乳類動物細胞是無毒且具備生物惰性的，研究者通選用海藻酸鈉通過微相分離制備得到具有互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、相分離的復(fù)合ECM衍生水凝膠（rECM）。通過分別對ECM和海藻酸鈉進行熒光標(biāo)記，研究者發(fā)現(xiàn)ECM組分均勻分布于凝膠塊體中，且保留了微觀的相分離結(jié)構(gòu)。對比海藻酸鈉水凝膠，ECM復(fù)合的水凝膠增強了剪切應(yīng)力下的機械強度。細胞生物學(xué)評價表明小鼠肺上皮細胞（MLE12）及人肺上皮細胞（A549）均能在海藻酸鈉凝膠和ECM復(fù)合水凝膠中實現(xiàn)良好的增殖效果，通過5-乙炔-2′-脫氧尿苷（EdU）染色，探究rECM水凝膠中MLE12的增殖情況，流式細胞術(shù)檢測數(shù)據(jù)表明ECM成分具有較高的生物活性并能誘導(dǎo)其增殖（圖1）。

圖1 rECM復(fù)合水凝膠的力學(xué)及細胞相容性表征

促血管生成的3D打印結(jié)構(gòu)有利于移植物的長期存活，研究者利用雞胚絨毛尿囊膜實驗評價凝膠的體外成血管能力，研究發(fā)現(xiàn)，相比基底膜提取物（BME）組，rECM凝膠組明顯促進了新血管生成。體內(nèi)凝膠的皮下植入試驗結(jié)果表明，rECM復(fù)合水凝膠減少了促炎癥M1巨噬細胞的增加，也表明了抑制M1表型對組織再生的重要性，且rECM水凝膠支架中含有完整的新生血管網(wǎng)絡(luò)（圖2）。

圖2 rECM復(fù)合水凝膠的血管生成性能表征

為了驗證rECM生物墨水是否具有生成生物組織的潛能，研究者測試了來自肺組織ECM的rECM復(fù)合水凝膠是否能夠支持從正常人呼吸道分離的原代上皮祖細胞的生長和分化。研究者將人類支氣管上皮細胞（HBECs）接種于凝膠表面，培養(yǎng)7天形成單層細胞層，之后提起至氣液界面，模擬體內(nèi)的組織環(huán)境，孵育培養(yǎng)一個月。熒光染色表明細胞粘附生長于凝膠表明，形成多層上皮層，且上皮細胞保留了基底祖細胞表型標(biāo)志物的表達。在證實了人類rECM生物墨水具有優(yōu)異的流變學(xué)和生物學(xué)屬性后，研究者測試了其3D生物打印亞段支氣管的能力，亞段支氣管直徑約為4mm，由外平滑肌層和內(nèi)上皮層組成。所打印的支氣管結(jié)構(gòu)包含三層細胞，內(nèi)層是HBECs細胞層，外部兩層是人肺平滑肌細胞（HLSMCs）細胞層。經(jīng)過7天的培養(yǎng)基液體環(huán)境中培養(yǎng)和氣-液界面環(huán)境下的28天孵育后，3D生物打印人體氣管的內(nèi)腔均保持開放狀態(tài)，沒有明顯的尺寸變化，這表明該結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定時間至少可達28天。

圖3 rECM復(fù)合水凝膠用于呼吸道組織的構(gòu)建

綜上所述，復(fù)合ECM組分，研究者通過微相分離產(chǎn)生了dECM增強性的的組織特異性rECM水凝膠，該類生物墨水能在體外3D生物打印出人類呼吸道上皮祖細胞和平滑肌細胞組成的氣管空腔結(jié)構(gòu)。該研究為下一代組織特異性生物墨水的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)，并使3D生物打印組織應(yīng)用于臨床移植成為可能。