蘭州大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)在3D打印骨軟骨方面取得進(jìn)展

來源：高分子科學(xué)前沿 and 蘭州大學(xué)

近年來，3D打印技術(shù)突飛猛進(jìn)。相比于傳統(tǒng)技術(shù)，3D打印技術(shù)更加精準(zhǔn)和高效。它與普通的平面打印原理基本一致，只不過普通打印機(jī)內(nèi)的“打印材料”是墨水和紙張，而3D打印機(jī)中是金屬、塑料、細(xì)胞等實(shí)物，它將打印材料一層層疊加起來，最終把計(jì)算機(jī)上的藍(lán)圖變成立體的實(shí)物。

3D打印軟骨可以用在修復(fù)人體軟骨的缺損上，它不僅能修復(fù)病理性軟骨缺損，而且能修復(fù)創(chuàng)傷性軟骨缺損，所以3D打印軟骨于治愈與軟骨相關(guān)的重大疾病和維護(hù)人類健康而言具有重大意義。

雖然只是人體骨格連接處很小的一部分，但軟骨卻是人身體上不可或缺的重要組成部分，人的坐臥行走都需要它的參與�？墒牵�因?yàn)檐浌菦]有血管、神經(jīng)及干細(xì)胞，所以不像人體其他組織具有自我修復(fù)的能力，想要修復(fù)只能依靠人為干預(yù)。

蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院范增杰教授及其團(tuán)隊(duì)充分利用3D打印這一新興技術(shù)，聯(lián)合美國康涅狄格大學(xué)化學(xué)與生物分子工程系SunLuyi教授團(tuán)隊(duì)，通過物理交聯(lián)、光交聯(lián)和化學(xué)交聯(lián)三種交聯(lián)方法首次設(shè)計(jì)并成功制備了一種三層梯度結(jié)構(gòu)的軟骨支架，日前，該研究成果以“3D打印羥基磷灰石梯度的水凝膠支架有效修復(fù)大鼠的骨軟骨缺損”為題發(fā)表在 《先進(jìn)功能材料》（AdvancedFunctionalMaterials）上。

國際獨(dú)創(chuàng)

軟骨修復(fù)必須有能夠促使它自身分化的細(xì)胞，但是軟骨細(xì)胞沒有分化功能，必須讓干細(xì)胞介入來使軟骨擁有自我修復(fù)的能力，所以軟骨修復(fù)一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)和難點(diǎn)。

基于此，范增杰團(tuán)隊(duì)致力于設(shè)計(jì)出一種能夠高度還原軟骨組織的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)能夠誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為軟骨和骨細(xì)胞，從而在缺損的地方形成一個(gè)完整的軟骨組織。

在剛開始構(gòu)建軟骨時(shí)，范增杰團(tuán)隊(duì)并沒有想到引進(jìn)3D立體技術(shù)，而是采用了傳統(tǒng)的浸泡法。相較于3D打印技術(shù)，浸泡法流程更加復(fù)雜，“因?yàn)檐浌墙M織本身很復(fù)雜”。

軟骨細(xì)分為三層，最外層為軟骨層，再往下一層是鈣化層，最里面一層是軟骨下骨層，這三層由外向內(nèi)硬度依次遞增，形成一個(gè)由軟到硬逐漸過渡的梯度結(jié)構(gòu)。同時(shí)，這三層的化學(xué)組成也存在差異，軟骨層不含任何礦物質(zhì)、全部由膠原纖維構(gòu)成；鈣化層含有30%左右的羥基磷灰石；軟骨下骨層大概含有70%的羥基磷灰石，由此它們又形成了化學(xué)成分上的梯度結(jié)構(gòu)。

要想修復(fù)軟骨組織，就必須想辦法恢復(fù)這三層組織。

傳統(tǒng)的浸泡法需要分別泡三次水凝膠來模擬這三層。范增杰說：“浸泡法的前端需要先把水凝膠做出來，再放到模擬液里去泡。第一次泡低濃度的，第二次泡中濃度的，第三次泡高濃度的，這樣軟骨才能形成一個(gè)梯度。”通過浸泡法分別將每一層泡好后再把三層疊加，雖然也能達(dá)到3D打印技術(shù)的效果，但其制備流程繁雜，并且所用時(shí)間漫長、效率很低。另外，浸泡法還不能規(guī)避溶脹的弊端，“如果水凝膠材料泡水時(shí)間太長，它就會發(fā)生溶脹，一溶脹，它的尺寸穩(wěn)定性就不那么好了�！�

到底怎么樣才能高效保質(zhì)地模擬出軟骨組織呢？范增杰及其團(tuán)隊(duì)將目光轉(zhuǎn)向了3D打印技術(shù)，“因?yàn)?D打印技術(shù)具有提供高效精準(zhǔn)的軟骨組織修復(fù)方法的可能性�！�

他們首先用電腦建模，把軟骨的形狀、大小都設(shè)計(jì)好，然后制備墨水，使用多頭3D打印機(jī)來打印。第一個(gè)噴頭不加羥基磷灰石，打印出軟骨的第一層，第二個(gè)噴頭打印鈣化層，第三個(gè)打印軟骨下骨層，一層一層疊起來，直到形成一個(gè)比較完善的軟骨結(jié)構(gòu)。由3D打印技術(shù)打印出的軟骨組織有較低的溶脹率和較高的修復(fù)率，因此它能夠更好地修復(fù)人體軟骨缺損，“這在國際上完全是我們獨(dú)創(chuàng)的”。

撥云見日
研究中，范增杰團(tuán)隊(duì)時(shí)刻關(guān)注著3D打印軟骨技術(shù)在國際上的發(fā)展?fàn)顩r，他發(fā)現(xiàn)國際上在軟骨打印方面存在一定弊端：“國際上現(xiàn)在依然沒有辦法同時(shí)模擬出兩種梯度的軟骨結(jié)構(gòu)來，要么只有軟骨的化學(xué)梯度結(jié)構(gòu)，要么只有軟硬梯度結(jié)構(gòu)，還沒有人能夠做出同時(shí)具有兩種梯度的軟骨結(jié)構(gòu)�！比缜拔乃�述，這主要是因?yàn)檐浌堑娜龑犹荻人�含有的化學(xué)成分不同而導(dǎo)致精準(zhǔn)調(diào)控三層的化學(xué)比例難度很大，“國際上還沒有辦法在保證軟硬梯度的同時(shí)兼顧化學(xué)梯度，而軟骨的修復(fù)需要需要同時(shí)實(shí)現(xiàn)兩方面的梯度結(jié)構(gòu)。”

“看到國際上3D打印有局限性，所以我們就想再往前走一步，研究出一種同時(shí)實(shí)現(xiàn)軟硬和化學(xué)這兩方面的梯度結(jié)構(gòu)的理論設(shè)計(jì)。”

實(shí)踐過程可謂困難重重，“因?yàn)檫@方面是一個(gè)沒有前人做過的工作，所以就沒有可以參照的對象”。

團(tuán)隊(duì)面對的第一重困難便是打印墨水的制備，也就是打印軟骨原材料的制備。墨水中有一種化學(xué)物質(zhì)叫海藻酸鈉，這種物質(zhì)在打印過程中和氯化鈣的鈣離子反應(yīng)從而容易產(chǎn)生團(tuán)聚，團(tuán)聚后的物質(zhì)堵住打印所用注射器的針頭，打印就無法正常進(jìn)行下去，因此整個(gè)打印流程中最關(guān)鍵的一步就是打印墨水的制備。

為了解決這個(gè)令人頭疼的問題，團(tuán)隊(duì)經(jīng)過反復(fù)討論終于想到了解決方法，他們在打印過程中增加了噴涂裝置，這一裝置能夠延緩團(tuán)聚的反應(yīng)，“這是我們的創(chuàng)新做法，在原來基礎(chǔ)上新建了噴涂裝置，這是一個(gè)霧化裝置，因?yàn)殪F化比較緩慢，這樣反應(yīng)的時(shí)間就延長了，物質(zhì)就不會很快團(tuán)聚，也就不會堵住打印針頭�！�

團(tuán)隊(duì)面臨的第二重困難是軟骨如何成形的問題。剛開始打印軟骨的時(shí)候沒有想到用雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，所以在往水凝膠中加羥基磷灰石的過程中，一旦其含量加到70%時(shí)，水凝膠系統(tǒng)就會發(fā)生坍塌，就像往果凍里注入其他物質(zhì)會讓果凍破碎一樣，“所以如果沒有雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，整個(gè)軟骨就無法成形。”

對于如何維持軟骨理想的形態(tài)問題，范增杰團(tuán)隊(duì)的研究進(jìn)程又一次陷入了瓶頸，原來單一的結(jié)構(gòu)無法保持軟骨形態(tài)的穩(wěn)定性。為此，團(tuán)隊(duì)咨詢了SunLuyi教授的意見，“孫教授提供了一些建設(shè)性、指導(dǎo)性的意見，他在材料性方面很專業(yè)，補(bǔ)充我們這方面的知識缺陷，雙方優(yōu)勢互補(bǔ)�！�

經(jīng)過雙方團(tuán)隊(duì)的深入探討和共同努力，范增杰團(tuán)隊(duì)在原來的基礎(chǔ)上引進(jìn)了雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。雙網(wǎng)絡(luò)有軟硬兩種結(jié)構(gòu)，硬的結(jié)構(gòu)起支架的作用，軟的結(jié)構(gòu)用來分散力量，“因?yàn)檐浀慕Y(jié)構(gòu)可以拉伸，遇到強(qiáng)力的時(shí)候，軟的結(jié)構(gòu)能夠輕松將力分解掉，所以軟硬兼有的雙網(wǎng)絡(luò)能夠幫助軟骨成形，并且讓軟骨擁有顯著的力學(xué)性能。要做成軟骨的話，水凝膠必須有好的力學(xué)性能，所以如果沒有雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，水凝膠會坍塌，很難保證最后打印出來的軟骨形狀”，范增杰說道。

研究人員的缺乏同樣是團(tuán)隊(duì)面臨的一大問題。團(tuán)隊(duì)主要由本科生和研究生組成，“學(xué)生需要首先保證課程學(xué)習(xí)，然后才能投身科研工作，如果有博士生，可能投入科研工作的時(shí)間精力就能更充足一些。但我們的學(xué)生都很努力，今年疫情期間學(xué)生基本也都沒回家，一直在實(shí)驗(yàn)室加班加點(diǎn)趕項(xiàng)目進(jìn)度。”

量身定“骨”

在范增杰團(tuán)隊(duì)的研究中，他們實(shí)現(xiàn)了根據(jù)軟骨具體的缺損情況進(jìn)行針對性建模打印，即根據(jù)病人軟骨的缺損情況進(jìn)行個(gè)性化建模，打出來的軟骨完全符合缺損的形狀，“3D打印技術(shù)一大優(yōu)點(diǎn)就是個(gè)性化。每個(gè)病人軟骨缺損的深度、形狀和尺寸都不一樣，我們可以直接運(yùn)用3D技術(shù)先掃描他的缺損部分，然后再把他缺損的部分呈現(xiàn)出來，這是傳統(tǒng)的浸泡法無法做到的�！苯�泡法無法嚴(yán)格控制軟骨的形狀，這就會導(dǎo)致制備出的軟骨的尺寸和實(shí)際缺損尺寸有較大誤差。所以3D打印技術(shù)使整個(gè)軟骨制作的制備過程效率得到顯著提高：“以前浸泡法復(fù)雜的制備過程，現(xiàn)在3D打印一步就解決了。”

為了早日能夠?qū)⒋蛴〕龅能浌峭茝V應(yīng)用到人身上，團(tuán)隊(duì)首先在大鼠身上做實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)剛開始需要先在大鼠的骨頭上磨開一個(gè)洞，之后將它軟骨的三層結(jié)構(gòu)都破壞掉，然后把打印好的軟骨給它放進(jìn)去，再進(jìn)行縫合。“我們做了很多實(shí)驗(yàn)，測試過程中犧牲了好多老鼠，這個(gè)過程實(shí)際上來說是很長的，因?yàn)槔鲜蠊穷^重新長好至少需要三個(gè)月的時(shí)間�！比齻�(gè)月以后，通過肉眼觀測和專業(yè)的MicroCT（微型CT）檢測，團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)大鼠的骨總量增加了，不僅長有軟骨，而且長有硬骨，這個(gè)結(jié)果為以后應(yīng)用于人體提供了很高的可能性。

接下來，團(tuán)隊(duì)致力于將3D打印軟骨技術(shù)推廣到人體應(yīng)用上，范增杰說：“前期的動物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)做完了，我們已經(jīng)在推進(jìn)臨床試驗(yàn)，未來可能會跟蘭大一院、蘭大二院合作�！�

但3D軟骨真正走向人體還需要漫長的過程，在這個(gè)過程中，需要經(jīng)過國家的各項(xiàng)嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)和檢測，這就要求3D技術(shù)要盡善盡美。

團(tuán)隊(duì)希望，未來3D技術(shù)能夠達(dá)到硬骨和軟骨缺損同步修復(fù)的效果：“現(xiàn)在3D打印在硬骨缺損方面做的比較多，但是在硬骨和軟骨缺損一起修復(fù)的方面比較少。現(xiàn)在大部分軟骨缺損的人不是表面一層軟骨的創(chuàng)傷，而是軟骨和下面的硬骨整個(gè)一起創(chuàng)傷。現(xiàn)在來說3D打印基本上是打印軟骨的只打印軟骨，打印硬骨的只打印硬骨，都沒有把下邊的硬骨和上面的軟骨一起構(gòu)建出來�，F(xiàn)在我們團(tuán)隊(duì)有前期的工作基礎(chǔ)了，未來希望能夠完整打印出來一塊既有軟骨又有硬骨的骨組織。如果能打印出來，它的意義就非常大了。”

部分原文Figures:

圖1.3D打印梯度支架修復(fù)大鼠骨軟骨缺損的流程圖。(A)電子噴霧裝置。(a-c)分別為“0% nHA”、“40% nHA”和“70% nHA”墨水。(i)-(iii):骨軟骨區(qū)的淺層(軟骨)、中層(鈣化軟骨)和深層(軟骨下骨)。( SA:海藻酸鈉; CA:海藻酸鈣; AM:丙烯酰胺; PAM:聚丙烯酰胺)。

該研究制備的三維支架由軟骨層（純水凝膠）、模擬鈣化軟骨的界面層（40/60%（w w-1）nHA/水凝膠）和模擬軟骨下骨層的70/30%（w w-1）nHA/水凝膠底層組成，具有三層梯度結(jié)構(gòu)，能夠精確地與軟骨、鈣化軟骨和軟骨下骨的生物醫(yī)學(xué)功能相匹配。具體的制備過程見圖2。該過程可分為三個(gè)主要步驟：(1) 三種水凝膠墨水的制備；(2) 3D打印墨水；(3) 先后進(jìn)行光交聯(lián)和Ca2+交聯(lián)。最重要的技術(shù)創(chuàng)新在于應(yīng)用電子噴涂裝置來控制Ca2+的緩慢釋放以防止海藻酸鈣的快速形成，這使得70/30%（w w-1）nHA/水凝膠層的打印成為可能。

圖3.各種3D打印支架的照片。(A)從左至右分別為“0% nHA”、“40% nHA”、“70% nHA”(用羅丹明染成紅色)和“G-nHA”。(B)3D打印人工半月板的模型: “0% nHA”(a)、 “40% nHA”(b)、“70% nHA”(c)和“G-nHA凝膠(d);(e&f)分別為浸泡在CaCl2溶液前后的圖片。(C)進(jìn)行拉伸測試的水凝膠支架:“0% nHA”(a)、“40% nHA”(b)、“70% nHA”(C)和“G-nHA”(d)的俯視圖，以及(e)“G-nHA”支架的側(cè)視圖。

圖4. 不同nHA/水凝膠質(zhì)量比的支架材料的表征。A) FTIR光譜；B)XRD圖譜；C)SEM圖像；D)和E)不同支架的拉伸和壓縮強(qiáng)度。

圖5. 大鼠6周和12周后的骨軟骨再生的大體觀和微CT掃描圖像。(紅色矩形表示缺陷區(qū)域;白色箭頭表示未完全降解的支架和骨樣組織的混合物)

圖6. 大鼠骨軟骨再生的染色分析。(A-G)分別為對照組、BMSCs組、“G-nHA”組、“0% nHA+BMSCs”組、“40%nHA+BMSCs”組、“70%nHA+BMSCs”組、“G-NHA+BMSCs”組。(紅色箭頭:正常組織與再生組織的分界;黑色箭頭:降解支架留下的缺損區(qū)域)