東華大學：絲素蛋白與氧化纖維素結(jié)合用于3D打印組織工程支架

來源：東華生物質(zhì)材料成型與加工課題組


蠶絲和纖維素是自然界中原料來源豐富的兩種天然生物材料，在組織工程支架的研究中都發(fā)揮著重要的作用。然而，傳統(tǒng)組織工程支架在結(jié)構(gòu)仿生性方面存在許多局限性，3D打印新技術(shù)的出現(xiàn)，有望實現(xiàn)組織工程支架的個性化定制。蠶絲中的絲素蛋白（SF）主要由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸三種簡單的氨基酸組成，具有兩親性，可形成皮升到納升的蛋白液滴用于液滴印刷，也可通過調(diào)控其流變性能實現(xiàn)擠出打印。但僅僅利用RSF溶液的擠出3D打印高分辨率的支架依然存在較大困難，其原因在于：（1）SF溶液僅在濃度小于20 wt%時呈現(xiàn)切力變稀的特性，但是低濃度下溶液成型困難；當濃度大于20 wt%時呈現(xiàn)牛頓流體行為，不適于打�。唬�2）在擠出過程中高濃度的SF溶液會在剪切力的誘導下形成β-折疊結(jié)晶結(jié)構(gòu)，導致打印頭堵塞，阻礙打印線條的順暢性。因此，無添加或少添加的SF溶液的3D打印存在巨大的挑戰(zhàn)。纖維素材料具有較高的結(jié)晶度和剛度，是非常優(yōu)異的復合材料增強填料。然而，纖維素分子內(nèi)/間的大量氫鍵網(wǎng)絡(luò)限制了其應(yīng)用。盡管如此，纖維素分子鏈上大量的羥基也提供了對其進行化學修飾的可能，經(jīng)過氧化處理的纖維素納米纖維具有優(yōu)異的流變性能可用于3D打印制備。

圖1：實驗設(shè)計原理圖

東華大學纖維材料改性重點實驗室張耀鵬、楊革生副研究員與上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科任濤教授、泌尿外科宋魯杰副主任醫(yī)師合作，通過3D打印技術(shù)制備SF/氧化納米纖維素水凝膠組織工程支架用于肺組織再生。首先利用TEMPO氧化細菌纖維素（BC），破壞BC的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，制備分散性好的氧化細菌纖維素（OBC）漿料，OBC漿料具有高零切粘度、高模量、切力變稀的特點，通過OBC漿料增稠SF水溶液制備墨水進行打印，隨著OBC比例提高，墨水的可打印性Pr趨近于1，墨水的可打印性、打印線條的保真度提高（圖2）。復合墨水中的OBC納米纖維在打印針頭的剪切力誘導下發(fā)生沿著打印線條軸向取向排列（圖3）。利用辣根過氧化物酶HRP/H2O2對SF進行交聯(lián)，SF/OBC的復合水凝膠形成了類似“鋼筋混凝土”結(jié)構(gòu)（圖1），1RSF-1OBC水凝膠的最大壓縮強度達到（267.0±13.0）kPa，壓縮剛度可達（325.4±14.3）kPa（30%應(yīng)變），壓縮應(yīng)變大于50%。肺上皮干細胞在1RSF-1OBC打印支架上能夠很好地粘附增殖，OBC納米纖維能夠引導干細胞沿著打印線條軸向有序生長（圖4）。而且，肺上皮干細胞在1RSF-1OBC打印支架上生長1周后仍然能夠維持其干性（Ki67）和上皮表型（p63），為干細胞在1RSF-1OBC打印支架上的進一步分化提供了可能。因此，3D打印的SF/OBC水凝膠支架在肺再生組織工程中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

圖2：打印網(wǎng)格的數(shù)碼照片：（a）2RSF-1OBC，（b）1RSF-1OBC，（c）1RSF-2OBC，（d）OBC，右上角插圖是墨水相應(yīng)的打印多層（>2層）結(jié)構(gòu)俯視圖，（e）打印線條的寬度比較，（f）半定量表征墨水可打印性（Pr），標尺：10 mm

圖3：（a）打印線條的SEM圖及（b）對應(yīng)的2D-WAXD圖中OBC[200]晶面的取向：（i）2RSF-1OBC，（ii）1RSF-1OBC，（iii）1RSF-2OBC，（iv）OBC ，標尺：500 mm, 放大圖1 mm

圖4：肺上皮干細胞在1RSF-1OBC支架上培養(yǎng)（a）3天和（b）7天增殖情況的熒光染色；（c、d、f）肺上皮干細胞在1RSF-1OBC支架上培養(yǎng)7天后的生長形態(tài)分布，白箭頭指示打印線條長軸方向；肺上皮干細胞在1RSF-1OBC支架上培養(yǎng)7天后對應(yīng)的（g）Ki67和（h）p63免疫熒光染色；（i）肺上皮干細胞在1RSF-1OBC水凝膠材料和TCPS上增殖情況（*p<0.05）

相關(guān)研究成果以題為3D Printed Hydrogels with Oxidized Cellulose Nanofibers and SilkFibroin for the Proliferation of Lung Epithelial Stem Cells發(fā)表在Cellulose上。東華大學博士生黃利為論文第一作者，碩士生苑煒、洪玥博士、范蘇娜博士和姚響副教授為共同作者，張耀鵬教授、楊革生副研究員為共同通訊作者。


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https://link.springer.com/article/10.1007/s10570-020-03526-7