綜述：生物3D打印肝臟體外模型進(jìn)展

來源： EngineeringForLife

三維生物打印技術(shù)是一種新興的技術(shù)，由于其能夠精確控制細(xì)胞的空間分布和周圍的微環(huán)境，在組織和器官構(gòu)建方面具有巨大的潛力。它可以在空間上排列細(xì)胞、生物材料和生長因子，以形成類似組織的3D結(jié)構(gòu)。生物3D打印可以構(gòu)建復(fù)雜的異質(zhì)器官，有助于解決全球器官移植短缺的危機(jī)。

肝臟是人體最大的腺體，在新陳代謝、膽汁產(chǎn)生、解毒、凝血、免疫、產(chǎn)熱、調(diào)節(jié)水和電解質(zhì)等500多種生化反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。肝臟含有幾種類型的細(xì)胞:肝細(xì)胞(HCs)、肝星狀細(xì)胞(HSCs)、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSECs)、Kupffer細(xì)胞(KCs)和膽汁上皮細(xì)胞(BECs)。所有這些細(xì)胞都按特定的順序緊密排列在六邊形的肝小葉中，肝小葉是肝臟的基本組成部分;每個肝臟含有半個到一百萬個肝小葉。

肝腺泡是肝臟最小的功能單位。它包括兩個六分之一的肝小葉。根據(jù)內(nèi)部代謝產(chǎn)物的濃度梯度，可以將一個腺泡(圖1)劃分為三個區(qū)域。隨著營養(yǎng)和氧濃度從外部(圖1，區(qū)域I)到中心(圖1，區(qū)域III)的降低，肝臟的再生能力和代謝率也降低。此外，肝臟有兩個供血系統(tǒng):(i)經(jīng)門靜脈來自胃腸道的靜脈血和(ii)經(jīng)肝動脈來自體循環(huán)的動脈血。

在過去的幾十年里，肝病已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的主要死亡原因之一。根據(jù)全球健康觀察的元數(shù)據(jù)，乙肝和丙肝兩種肝臟相關(guān)疾病被列為全球十大疾病之一。中國約有五分之一的人患有肝病。乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、肝硬化、肝癌、酒精性肝病(ALD)、非酒精性脂肪肝(NAFLD)、藥物性肝損傷是影響肝臟健康的主要疾病。

為了有效降低肝病的發(fā)病率和死亡率，有必要開發(fā)出療效更好、副作用更小的藥物�，F(xiàn)有的研究方案下，新藥通常是通過在二維單層細(xì)胞培養(yǎng)物和動物實(shí)驗中開發(fā)出來的。然而，這些方法昂貴且費(fèi)時。并且，二維單層細(xì)胞培養(yǎng)不能真實(shí)反映藥物在人體內(nèi)的實(shí)際代謝微環(huán)境，使用動物進(jìn)行實(shí)驗存在倫理問題，實(shí)驗動物模型與人的代謝存在差異。

制藥行業(yè)迫切需要在體外實(shí)現(xiàn)肝臟復(fù)雜的生理微環(huán)境，重現(xiàn)肝臟代謝功能的肝臟組織模型。因此，有必要開發(fā)一種體外模擬人肝臟的新技術(shù)，以使藥物的開發(fā)、篩選和試驗穩(wěn)定，保證藥物的高效低毒，推進(jìn)肝臟疾病的研究。

圖1  生物3D打印體外肝組織模型的構(gòu)建示意圖

三維生物打印肝臟組織和肝芯片分別可以更好地模擬肝臟的體內(nèi)靜態(tài)微環(huán)境和動態(tài)微環(huán)境。這些新興技術(shù)可以用來操縱細(xì)胞排布組裝成特定結(jié)構(gòu)�？朔�了二維培養(yǎng)的局限性，能夠更好地模擬了體內(nèi)微環(huán)境的復(fù)雜性。

文章首先系統(tǒng)介紹了現(xiàn)有生物3D打印制造體外肝組織模型的主要技術(shù)以及可被用于打印的肝臟細(xì)胞。

之后，分別從打印靜態(tài)培養(yǎng)的肝組織與動態(tài)培養(yǎng)的肝芯片兩個角度來闡述目前體外肝組織模型打印的研究進(jìn)展。

1. 體外肝臟組織打印
生物3D打印能夠精確地排布細(xì)胞，可分為擠出式、噴墨式和光固化式的打印方法。
【優(yōu)勢】多噴頭能夠構(gòu)建異質(zhì)多細(xì)胞體外組織，通過對噴頭的精確控制，可構(gòu)建復(fù)雜結(jié)構(gòu)。能夠克服二維細(xì)胞培養(yǎng)的局限性。
【局限性】生物打印分辨率與噴頭及平臺移動精確度有關(guān)，如今打印精度依然較低。

圖3  肝臟組織三維生物打印模型的構(gòu)建

除了生物材料支架包裹的細(xì)胞外，另一種無水凝膠的三維培養(yǎng)模型是基于細(xì)胞球狀體。球狀體是自組織的球形細(xì)胞聚集體。原發(fā)性造血干細(xì)胞可形成球狀體來維持其表型和功能。

肝球體構(gòu)造的傳統(tǒng)方法包括懸滴法、微波陣列法和磁組裝法。由于不同的表型和體外細(xì)胞培養(yǎng)特性，每種方法的應(yīng)用細(xì)胞類型也不同，這也影響了細(xì)胞聚集形成的效果，包括球形直徑和穩(wěn)定性。

與基于支架的模型相比，無支架模型成本低，不需要水凝膠。然而，它們不能用來構(gòu)建復(fù)雜的非均勻微觀結(jié)構(gòu)。

2. 肝芯片打印
肝芯片是一種基于動態(tài)微流控芯片的體外干細(xì)胞培養(yǎng)生物芯片模型�；�于動態(tài)微流體的體外肝臟系統(tǒng)可以精確控制細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境，如溫度、pH值、細(xì)胞剪切應(yīng)力、氧氣、營養(yǎng)供應(yīng)和廢物去除。

三維生物打印技術(shù)可以應(yīng)用于芯片上肝的各個制作階段，包括芯片框架、嵌入的肝組織支架以及整個芯片的打印。

為了引出3D打印肝芯片，文章首先對傳統(tǒng)微納方法制備肝芯片進(jìn)行了簡單介紹，微納制造光刻肝芯片，通過制造微米級流道控制液體來灌注培養(yǎng)芯片內(nèi)部的細(xì)胞。

圖3 Liver-on-chips模仿肝臟結(jié)構(gòu)和功能

傳統(tǒng)制造芯片上微流體肝的方法是光刻法和復(fù)制模塑法，兩者具有時間成本與經(jīng)濟(jì)成本高的缺點(diǎn)。采用三維生物打印技術(shù)，不僅可以在更短的時間內(nèi)以更低的成本構(gòu)建芯片框架，而且可以在芯片上構(gòu)建復(fù)雜的肝支架嵌入芯片內(nèi)，用于灌注培養(yǎng)。

圖4 3D生物打印肝臟芯片

傳統(tǒng)藥物開發(fā)方法昂貴費(fèi)事且失敗率高，通過構(gòu)建更能模擬體內(nèi)肝臟微環(huán)境的體外模型，能夠作為藥物開發(fā)新技術(shù)，解決器官體外再生移植供體短缺的問題。

三維生物打印肝組織支架和肝芯片是兩種構(gòu)建體外肝臟模型的主要技術(shù)。生物3D打印能夠?qū)崿F(xiàn)使用多種生物墨水，通過對噴頭的精確控制，實(shí)現(xiàn)體外異質(zhì)多細(xì)胞肝模型的構(gòu)建。肝芯片上的微流體通道能夠精確地控制液體，可以降低細(xì)胞灌注培養(yǎng)時的剪切應(yīng)力，減小對細(xì)胞的損傷，并且多流道結(jié)構(gòu)設(shè)計可以模擬肝臟的味觀結(jié)構(gòu)。

將3D生物打印技術(shù)應(yīng)用于芯片構(gòu)建肝臟，除了為篩選藥物和確定肝臟疾病的分子機(jī)制提供強(qiáng)大的平臺外，體外肝臟組織模型的開發(fā)也將變得更加高效和經(jīng)濟(jì)。

相關(guān)論文“Current Advances on 3D-Bioprinted Liver Tissue Models”已被Wiley旗下期刊Advanced Healthcare Materials在線刊登，浙江大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院楊華勇院士團(tuán)隊生物制造方向馬梁講師為本文第一作者及通訊作者，吳鈺桐碩士生為共同第一作者，其他共同通訊作者還有周竑釗博士后以及張斌副研究員。

論文鏈接：https://doi.org/10.1002/adhm.202001517