多尺度3D打印增強水凝膠——陶瓷支架

來源：EngineeringForLife  

在肌肉骨骼肌組織中，堅硬的礦化物質(zhì)和軟組織自然的結(jié)合，例如軟骨與骨骼的連接處。通過生物活性分子在關(guān)節(jié)面和軟骨下骨之間擴散，這種連接處在細(xì)胞間通訊起著關(guān)鍵作用。這樣的過濾功能和機械載荷的傳遞，有助于維持體內(nèi)平衡，實現(xiàn)關(guān)節(jié)功能。在老齡化人口中，關(guān)節(jié)軟骨的創(chuàng)傷和退化可能會導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎，這種疾病會破壞軟骨下骨，軟骨以及連接處。目前，主要利用水凝膠進行軟骨修復(fù)。然而，較軟的水凝膠很難與堅硬的材料結(jié)合作為再生支架或礦化組織的假體替代。因此，不同的機械性能的材料集成制造是一個重大挑戰(zhàn)。

近期，荷蘭烏得勒支大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院臨床科學(xué)系的PaweenaDiloksumpan團隊，在Biofabrication雜志上發(fā)表的“Combiningmulti-scale 3D printing technologies to engineer reinforced hydrogel-ceramic interfaces”文章，結(jié)合近場直寫和擠出打印技術(shù)，集成了水凝膠、陶瓷和聚合物材料。將基于模仿骨骼肌礦物相磷酸鈣（CaP）研發(fā)的生物陶瓷墨水采用擠出打印制造成軟骨下骨替代物，然后采用近場直寫制備聚合物網(wǎng)格固定在陶瓷墨水中，并嵌入載細(xì)胞的GelMA作為軟骨成分。研究了幾種微纖維結(jié)構(gòu)作為交聯(lián)劑來增強水凝膠-陶瓷界面的粘結(jié)，增強水凝膠的抗壓性能。

首先采用MEW制造直徑為8mm的圓柱支架。然后將C-PCaP直接打印在MEW的纖維網(wǎng)格上，形成直徑為6.3mm的生物陶瓷支架，前兩層沒有設(shè)計宏觀的孔隙來模擬軟骨下骨板，最后一層打印了一個700μm的絲間距，形成了一個模擬骨頭的錨。將陶瓷支架放置在37℃的環(huán)境中，MEW支架放置在10%w/v的GelMA溶液中，加入25mM的APS/TEMED使水凝膠發(fā)生化學(xué)交聯(lián)，完成了人造骨的濕潤。最后將整個結(jié)構(gòu)取出放置在25mM的APS/TEMED中并補充PBS，在37℃的環(huán)境下放置1h，保證C-PCaP和GelMA中的C-泊洛沙姆完成交聯(lián)。

圖1 軟骨支架的制造過程

研究者設(shè)計一種生物墨水，可以制造出高分辨率支架，并且能夠與不穩(wěn)定的聚合物和生物化合物產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。α-TPC是主要材料，并評估了兩種PCaP的配方：一種含有非交聯(lián)的聚甲醛組分(NC-PCaP)，另一種含有改性的交聯(lián)聚甲醛組分(C-PCaP)。兩種生物墨水的配方中固體顆粒與液體的配方都可以保證在擠出后維持形狀，可以在不需要支撐的情況下承受多層結(jié)構(gòu)。

圖2 流變學(xué)和打印參數(shù)的優(yōu)化

作為骨的替代者，打印結(jié)構(gòu)的機械性能是至關(guān)重要的，分別將NC-PCaP和C-PCaP進行了硬化和硬化交聯(lián)，得到不同的孔隙度的材料。進行無側(cè)限壓縮測試，從應(yīng)力-應(yīng)變曲線計算其切線模量、極限強度和破壞能量。其中所有的配方和孔隙設(shè)計都表現(xiàn)出松質(zhì)骨范圍內(nèi)的抗壓性能，NC-PCaP和C-PCaP兩種材料的切線模量、極限強度和對失效的能量值均隨著孔隙率的增加而逐漸降低，與預(yù)期的一致。但是NC-PCaP和C-PCaP打印支架的壓縮模量沒有明顯的差異。本研究選擇的高比率(70% w/w的顆粒含量)的材料，在可以維持打印形狀的保真度的同時，還可能會阻礙密集交聯(lián)聚合物網(wǎng)絡(luò)的形成，阻礙可能來自水凝膠共價交聯(lián)組成陶瓷的斷裂韌性的增加。然而，考慮到整體的抗壓性能和較高的打印分辨率，本研究的其余部分使用了C-PCaP。

圖3 機械性能

將MSCs細(xì)胞種植在支架上來評估細(xì)胞相容性和成骨性能，將MSCs直接種植在C-PCaP上可以明顯增殖。培養(yǎng)第7天時（圖4B），在培養(yǎng)基中檢測到較高的堿性磷酸酶的值和特征峰；培養(yǎng)到14天時，支架上可觀察到細(xì)胞呈現(xiàn)拉長形態(tài)（圖4C），在成骨培養(yǎng)基中檢測到骨的鈣化素增加（圖4D）；培養(yǎng)到21天后，可以觀察到支架的細(xì)胞出現(xiàn)成骨分化。驗證了以PCaP為主要成分的支架具有成骨再生的潛力。

圖4 PCaP支架的體外生物相容性評價

圖5所示，C-PCaP墨水不會改變PCL網(wǎng)格支架的結(jié)構(gòu)，當(dāng)水凝膠嵌入PCL網(wǎng)格后，原有的PCL支架的結(jié)構(gòu)和排列的纖維可以提高抗壓縮性能。因此C-PCaP可以與PCL網(wǎng)孔形成相互滲透的結(jié)構(gòu)，并且不改變原有的纖維結(jié)構(gòu)，對沉積陶瓷材料的細(xì)絲的形狀不會產(chǎn)生明顯的影響。

圖5 MEW纖維支架的微觀結(jié)構(gòu)及打印參數(shù)

為了進一步研究跨尺度支架可以在體外形成軟骨基質(zhì)的潛力，將入股增強網(wǎng)格支架注入含有ACPC細(xì)胞的GelMA,培養(yǎng)6周，與不含C-PCaP的進行了測試對比，評估在骨支撐材料存在的情況下獲得新軟骨的可能性。經(jīng)過6周的培養(yǎng)，ACPCs在微纖維增強的GelMA內(nèi)仍能存活，兩種結(jié)構(gòu)中均能觀察到軟骨樣細(xì)胞外基質(zhì)的沉積(圖6C)。此外，新合成的基質(zhì)也會影響細(xì)胞負(fù)載移植物的骨-軟骨界面的連接強度（圖6D），韌性也表現(xiàn)出類似的趨勢（圖6E）。在軟骨結(jié)構(gòu)和骨-軟骨結(jié)構(gòu)中分別檢測到II型膠原的產(chǎn)生。通過組織學(xué)分析檢測I型膠原沉積。這些結(jié)果驗證了ACPC向軟骨的分化不受磷酸鈣支架的阻礙，該支架可用于骨-軟骨修復(fù)技術(shù)的檢測。

圖6 人工骨軟骨塞中軟骨的體外沉積

結(jié)論：本研究中，將水凝膠與成骨材料結(jié)合，采用擠出打印和近場直寫技術(shù)的跨尺寸打印工藝，每個模塊的力學(xué)性能都可以通過纖維網(wǎng)格和打印多孔的陶瓷材料的內(nèi)部結(jié)構(gòu)控制。該方法主要依賴于低強度的直寫支架，提供可與天然軟骨相媲美的水凝膠增強和壓縮性能。由于PCaP墨水的打印和放置所用的生理溫度和環(huán)境條件具有兼容性，可以在膠合材料中直接固定直寫的PCL結(jié)構(gòu)。所用的材料和復(fù)合結(jié)構(gòu)不會影響細(xì)胞的存活，可以在體外進行骨和軟骨工程。該方法在結(jié)締組織再生醫(yī)學(xué)中設(shè)計多應(yīng)用的界面和復(fù)合材料具有廣泛的應(yīng)用前景。

論文鏈接：
https://dor.org/10.1088/1758-5090/ab69d9