大尺寸血管化組織的同軸生物3D打印方法

來(lái)源： EngineeringForLife

組織/器官內(nèi)的血供系統(tǒng)，為組織提供了必須的營(yíng)養(yǎng)及代謝交換。而組織體外重建時(shí)當(dāng)尺寸>200μm時(shí)，就會(huì)超出營(yíng)養(yǎng)/氧氣的擴(kuò)散極限，需要構(gòu)造豐富的血管系統(tǒng)，避免內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)輸送不暢。

2015年，我們提出組織+營(yíng)養(yǎng)通道一次性制造的同軸生物打印方法（Biomaterials, 2015，61, 203-215），用來(lái)制造帶有營(yíng)養(yǎng)流道的大尺寸結(jié)構(gòu)，如圖1所示。其基本原理是：將交聯(lián)劑/水凝膠材料分別通入同軸噴頭的內(nèi)/外通道，交聯(lián)劑和水凝膠在噴嘴出口處相遇，水凝膠發(fā)生快速交聯(lián)形成中空凝膠管，再將凝膠管通過(guò)層層沉積形成帶有流道的三維結(jié)構(gòu)。然而，當(dāng)時(shí)采用灌流內(nèi)皮細(xì)胞懸液進(jìn)行了血管化嘗試，效果不佳，因?yàn)楣嗔鲀?nèi)皮細(xì)胞懸液的方式只能實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)的血管化，故而15年的工作重點(diǎn)聚焦在提升大尺寸組織的營(yíng)養(yǎng)輸送效率。

圖1 同軸打印血管通道

16年我們開(kāi)始探索如何深化，19年我們通過(guò)耦合犧牲打印和同軸打印工藝，提出組織/血管同軸3D打印思路，以實(shí)現(xiàn)血管+結(jié)構(gòu)同步制造（圖2）。通過(guò)設(shè)計(jì)核/殼型的GelMA/明膠墨水，利用同軸噴頭將載組織細(xì)胞墨水(外噴頭)和載內(nèi)皮細(xì)胞犧牲墨水(內(nèi)噴頭)同時(shí)擠出，打印時(shí)犧牲墨水支撐流道，培養(yǎng)時(shí)犧牲墨水融化形成通暢的流道網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞從犧牲墨水中釋放，粘附于流道內(nèi)壁進(jìn)行血管化，實(shí)現(xiàn)從流道網(wǎng)絡(luò)到血管化網(wǎng)絡(luò)的轉(zhuǎn)變�；�于此方法，實(shí)現(xiàn)了血管化大塊組織結(jié)構(gòu)（≥1 cm）的打印及體外長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)（≥20 days），并成功將其應(yīng)用于血管化的腫瘤模型和骨組織的制造。

圖2 血管+結(jié)構(gòu)一次性打印原理

此外，在血管+結(jié)構(gòu)的一次性打印策略中，由于載細(xì)胞墨水和犧牲墨水相互協(xié)同作用，相互增強(qiáng)了各自的可打印性，能夠容易的實(shí)現(xiàn)復(fù)雜結(jié)構(gòu)的打印。同時(shí)，由于實(shí)體結(jié)構(gòu)的自支撐效應(yīng)，可打印具有較高保證度的三維復(fù)雜結(jié)構(gòu)，且在結(jié)構(gòu)內(nèi)的血管流道保持的較好（圖3）。

圖3 三維復(fù)雜血管流道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)打印

為了模擬生物體內(nèi)細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)組成多樣性，我們還模擬制造了多細(xì)胞或多材料組織結(jié)構(gòu)（圖4、圖5），采用多合一噴頭裝置，可以切換多種載細(xì)胞材料與犧牲材料進(jìn)行同步打印。打印時(shí)，選擇性的通入目標(biāo)載細(xì)胞材料，同時(shí)通入犧牲材料，可以打印出含有血管流道的多組分組織結(jié)構(gòu)體。

圖4 多組分血管流道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)打印原理

圖5 多組分血管流道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

為了驗(yàn)證血管流道網(wǎng)絡(luò)輸送營(yíng)養(yǎng)/氧氣的有效性，，我們打印了cm級(jí)的含血管流道網(wǎng)絡(luò)的大塊載細(xì)胞結(jié)構(gòu)體(10 mm × 10 mm × 10 mm)，并觀察結(jié)構(gòu)體不同部位的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況（圖6），細(xì)胞在整個(gè)流道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)內(nèi)均可逐漸伸展、遷移并連接，驗(yàn)證了流道網(wǎng)絡(luò)的傳輸營(yíng)養(yǎng)/氧氣的有效性。

圖6 培養(yǎng)第6天時(shí)，乳腺癌細(xì)胞在結(jié)構(gòu)內(nèi)逐漸伸展并連接

隨后我們驗(yàn)證了通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞自動(dòng)沉積生成血管化通道的可行性，經(jīng)驗(yàn)證內(nèi)皮細(xì)胞可以自沉積并粘附到血管流道內(nèi)壁，并隨著體外培養(yǎng)而增殖，最終覆蓋并內(nèi)皮化流道網(wǎng)絡(luò)，形成功能化的內(nèi)皮管腔。（圖7）。

圖7 內(nèi)皮細(xì)胞自動(dòng)沉積，可以有效的無(wú)死區(qū)的內(nèi)皮化流道，同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞在流道內(nèi)增殖、伸展連接形成功能化的內(nèi)皮管腔

最后基于血管+結(jié)構(gòu)一次性打印策略，我們打印了血管化的腫瘤組織，癌細(xì)胞在血管化組織結(jié)構(gòu)內(nèi)伸展，連接，同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋并內(nèi)皮化流道網(wǎng)絡(luò)，最終形成功能化的血管化腫瘤組織（圖8）。

圖8 血管化腫瘤組織

與此同時(shí)，隨著長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生血管新生芽朝向腫瘤組織內(nèi)部生長(zhǎng)（圖9），而且癌細(xì)胞會(huì)逐漸向血管流道方向遷移（圖10）。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明打印的血管化組織具有相應(yīng)的生物功能，模擬出了腫瘤組織的血管化、遷移和侵襲等特性。

圖9 血管出芽

圖10 癌細(xì)胞遷移

最后，我們還打印血管化骨組織（圖11），再次驗(yàn)證血管化大組織打印策略的有效性，血管+結(jié)構(gòu)一次性打印方法突破了大塊組織的體外制造瓶頸。

圖11 血管化骨組織

血管+結(jié)構(gòu)一次性打印方法簡(jiǎn)單實(shí)用，可有效的，無(wú)死區(qū)的使復(fù)雜血管流道網(wǎng)絡(luò)血管化，促進(jìn)了細(xì)胞的存活、伸展、遷移、連接及血管化組織的新生。同時(shí)載細(xì)胞墨水和犧牲墨水同軸打印自支撐實(shí)體結(jié)構(gòu)，使得復(fù)雜結(jié)構(gòu)的制造更加容易。而且，采用多合一噴頭，可實(shí)現(xiàn)多組分血管流道結(jié)構(gòu)的打印，使得多細(xì)胞或多細(xì)胞外基質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)制造成為可能。此外，打印的血管流道結(jié)構(gòu)后續(xù)可通過(guò)灌流培養(yǎng)，進(jìn)行實(shí)時(shí)灌流下的血管化組織發(fā)育成熟過(guò)程研究。血管+結(jié)構(gòu)一次性打印方法特別擅長(zhǎng)于大尺寸組織的體外重建。

相關(guān)論文“Directly Coaxial 3D Bioprinting of Large-scale Vascularized Tissue Constructs”近日刊登在Biofabrication雜志上。第一作者為邵磊博士生，通訊作者為賀永教授，傅建中教授、高慶博士后為共同通訊。

論文地址：
https://doi.org/10.1088/1758-5090/ab7e76