Science大作深化：旋轉(zhuǎn)光固化3D打印快速構建復雜活體組織

來源： EngineeringForLife

目前生物3D打印方法包括基于擠出，立體光刻(SLA)和數(shù)字光投影打印(DLP/ DMD)等（詳細生物3D打印分類可參考綜述：漫畫生物3D打印Part II：打印方法及工藝） 。這些打印方法都是基于層層堆積（layer-by-layer）來構建三維結(jié)構的，通常需要支撐材料來實現(xiàn)中空或懸垂結(jié)構的打印，大大限制了復雜結(jié)構的精確制造。此外，打印大尺寸組織結(jié)構需要很長的時間，這就迫使細胞在墨盒中留存時間過長，大大影響細胞活性。因此，提高打印效率和精度成為生物3D打印工藝研究的熱點和難點。

2019年1月加利福尼亞大學伯克利分校的Brett E.Kelly、Indrasen Bhattacharya、Hossein Heidari在Science上發(fā)表的“Volumetric additive manufacturing via tomographic reconstruction”提出一種全新的打印技術，他們開發(fā)了一種計算軸向光刻（CAL）方法，該系統(tǒng)能夠選擇性的固化容器內(nèi)的GelMA水凝膠（GelMA：甲基丙烯酸酯明膠，EFL可提供標準化的、成系列的GelMA產(chǎn)品），能夠把三維物體分解成為一組二維圖像并從不同的角度投射出來，讓光敏液體固化成所需要的三維形狀。在不同的精度和材料條件下，打印時間僅需30-120秒。該套系統(tǒng)的最高精度可以達到0.3毫米。

圖1 A)三維模型不同角度圖像的投射，B)打印原理，C) CAL打印過程中不同視角，D) 打印成品，E) D的清晰化模型 ，F(xiàn)) D的更大尺寸模型，G)添加紫色染料的F模型

隨后，瑞士洛桑理工學院的 Christophe團隊在CAL方法的基礎上，進一步提出了“高分辨率的層析制造法”技術，極大地提高了打印速度和尺寸范圍。該技術通過將一個圓柱形的樹脂容器設置成旋轉(zhuǎn)的，一邊有DLP調(diào)制器產(chǎn)生的光對容器進行照射，這些光與樹脂容器的旋轉(zhuǎn)運動同步顯示，在短短幾十秒的時間內(nèi)就可以實現(xiàn)打印的完成。相關論文“High-resolution tomographic volumetric additive manufacturing”發(fā)表于“Nature Communications”。

圖2高分辨率層析打印實驗裝置

近期，烏得勒支大學醫(yī)學中心Riccardo團隊，同瑞士洛桑理工學院Christophe團隊合作，在CAL技術的基礎上做出了更進一步深入研究，引入了一種體積生物打印(VBP)的概念，使得在幾秒到幾十秒的時間內(nèi)制造出具有任意大小和形狀的細胞負載結(jié)構，實現(xiàn)了在極短時間內(nèi)完成生物墨水厘米級的適用于臨床尺寸的精細結(jié)構成形，其成果“Volumetric Bioprinting of Complex Living-Tissue Constructs within Seconds”發(fā)表于“Advanced Materials”。

研究中針對以上傳統(tǒng)打印中出現(xiàn)的問題引入了體積生物打印(VBP)的概念，VBP技術能在幾秒到幾十秒的時間內(nèi)制造出具有任意大小和結(jié)構的整個細胞負載結(jié)構。VBP是受計算機斷層掃描(CT)的啟發(fā)，通過使用二維動態(tài)光場照射，從而制造更為復雜的物體，能夠?qū)崿F(xiàn)打印產(chǎn)物的分辨率在80um以下。體積打印技術將物體的分層打印變?yōu)橐淮涡詣?chuàng)建整個對象，從而克服了傳統(tǒng)生物打印技術因打印時間過長對細胞造成的損傷，其打印精度也到達了傳統(tǒng)打印方法無法企及的程度，可以打印出解剖學上正確的骨模型以及半月板的植入模型。該研究中的生物墨水被放在圓柱形容器中，以允許其實現(xiàn)空間選擇性交聯(lián)。為了實現(xiàn)這種三維空間中的劑量分布，容器被設置成可旋轉(zhuǎn)的，并與一系列2D光同步照射，通過一個DLP調(diào)制器和一個405nm激光光源，這些動態(tài)光被顯示到生物墨水中。

圖3 A)裝載有生物墨水的打印容器連接到一個旋轉(zhuǎn)平臺上，B)用于打印人體耳廓模型的層析投影示意圖，C)打印出來的水凝膠結(jié)構的效果圖

研究中選用GelMA為所打印生物材料，PBS為溶劑，LAP為光引發(fā)劑。由于打印過程中對于打印產(chǎn)物精確性的要求，光引發(fā)劑存在一個濃度上限，簡而言之，在配制生物墨水是要嚴格控制LAP的濃度范圍，使光能夠穿透整個打印結(jié)構的同時又必須能使生聚合，同時也要保證LAP毒性對細胞損傷降到最低。為了達到這一目的，光強度值至少要達到入射光強度的37%才能到達打印體的另一側(cè)(圖4A)。VBP在精準制造上的能力可見一斑，當通過比較計算機斷層掃描(CT)獲得的打印產(chǎn)物和原始STL文件時，得到打印的人類耳廓模型顯示體積變化僅為5.71±2.31%。與其他打印方法相比打印時間不受打印結(jié)構尺寸限制，打印物體放大二倍、三倍后同未進行放大處理的模型用時相同（圖4B），相對于擠出式打印方法、DLP打印方法的打印時間隨著打印模型體積的增大而增大，VBP打印方法占有極強的優(yōu)勢。DLP打印方法可通過減少每層提升時間來加速打印過程，但相對于VBP方法其使用時間也要高出一個數(shù)量級。在體積生物打印技術中，只要提供給光敏聚合物相同的輻照強度，打印時間就可以保持一致，而與打印物的體積無關。

圖4  A)生物墨水添加LAP后，光透過整個打印體量的圖形表示，B)使用不同的生物打印技術:VBP、擠出生物打印、DLP，按比例1×(0.15 cm 3)、2×(1.23 cm 3)和3×(4.14 cm 3)制作人耳模型的時間

其次VBP方法打印出的結(jié)構不會出現(xiàn)打印痕跡，打印物表面非常的光滑（圖5），在研究中的光學條件下，體積邊緣的分辨率僅為33微米。

圖5 通過(i)VBP打印、(ii)擠出式打印(iii)DLP(標尺= 500微米)打印的耳廓表面特寫圖像

VBP生物打印技術中，不需要犧牲材料就可以打印出懸臂部件。這一特性便于生成能夠可逆地變換打印后形狀的結(jié)構，如打印刺激響應材料(通常用于4D打印)結(jié)構。利用這一特性，本文設計了一種流體閥，通過懸浮打印從而得到封閉空間內(nèi)的球體，連接到流體系統(tǒng)時可正常工作（圖6）。使用VBP打印技術可實現(xiàn)對小梁結(jié)構和錯綜復雜、相互連接的多孔網(wǎng)絡的制造，超越了傳統(tǒng)基于擠壓的生物打印技術。使用體積打印方法，這些結(jié)構被成功地復制，最小的分辨率為144.69±13.55um。

圖6 流體球籠閥的VBP打印（i）計算機生成的閥門三維模型，（ii）打印閥門俯視圖(scale bar= 2 mm)，（iii）閥體流動的特寫(scale bar=1mm)，（iv）打開狀態(tài)（箭頭代表流動方向），（v）閉合狀態(tài)

使用VBP打印方法時，在室溫下進行打印有利于防止打印過程中的細胞沉積，室溫狀態(tài)下的GelMA生物墨水還為打印結(jié)構體提供了穩(wěn)定的定位，避免了因交聯(lián)后浮力的潛在變化或生物墨水容器的旋轉(zhuǎn)而致使的已打印部分的運動。即使在打印其他不像GelMA這樣的黏度隨溫度變化的光固化生物墨水時，由于VBP過程的快速，也可以實現(xiàn)均勻的細胞懸浮。最后,選擇性地交聯(lián)生物墨水后,未反應的生物墨水在37°C的環(huán)境下用PBS或水就可以很容易的沖洗掉。VBP生物打印作為一種無噴嘴的方法，不會出現(xiàn)擠出式打印中由于施加剪切應力而產(chǎn)生的細胞損傷和打印形貌破壞。活組織的功能主要歸功于其復雜的結(jié)構，對細胞命運起到?jīng)Q定性因素的是細胞外環(huán)境相關形態(tài)和生化信號的精確分布，在這一點上VBP打印方法可以很好的確保外環(huán)境的精確還原。

圖7 VBP打印出的半月板形結(jié)構相關評估和新組織形成 A)（i）計算機生成模型,（ii）生物墨水打印樣品體外培養(yǎng)28天 (scale bar= 2mm)，（iii）打印半月板的三維結(jié)構的CT掃描，（iv）整個打印過程中，觀察到7天內(nèi)細胞存活率很高.B)代謝活動在7天內(nèi)增加.C)新組織形成方面，打印結(jié)構中糖胺聚糖生成量的顯著增加，以及在28d培養(yǎng)期間半月板壓縮模量的增加.

綜上所述，本篇文章突出說明了VBP（體積打印）打印方法能夠快速創(chuàng)造大型的、自由形態(tài)的細胞結(jié)構，與傳統(tǒng)的生物打印方法相比，打印時間大大減少，并制造高細胞密度的打印物。VBP生物打印的快速性在組織打印和疾病模型研究上具有很大的優(yōu)勢，生成任意形狀的大型組織結(jié)構可以幫助患者特異性治療，VBP生物打印技術很可能廣泛應用于組織再生、體外組織和疾病模型研究以及軟機器人技術。


參考文獻：
[1] Kelly B E , Bhattacharya I , Heidari H , et al. Volumetric additive manufacturing via tomographic reconstruction[J]. Science, 2019.
[2] Damien Loterie，Paul Delrot，Christophe Moser, High-resolution tomographic volumetric additive manufacturing[J]. Nature Communications, 2020.
[3] Paulina Nuñez Bernal, Delrot P , Loterie D , et al. Volumetric Bioprinting of Complex Living-Tissue Constructs within Seconds[J]. Advanced Materials, 2019.